0:00:00.000,0:00:08.999
Tématem této přednášky je Funkce DNA: replikace jako molekulární podstata dědičnosti.

0:00:08.999,0:00:15.531
Přednáška je součástí modulu 1 Genetika zvířat, který je součástí projektu ISAGREED.

0:00:15.531,0:00:21.530
Vytvoření této prezentace bylo podpořeno grantem ERASMUS + KA2

0:00:21.530,0:00:32.527
Inovace struktury a obsahu studijních programů v oblasti managementu živočišných genetických a potravinových zdrojů s využitím digitalizace.

0:00:34.127,0:00:38.726
V rámci přednášky si nejprve vysvětlíme pojem replikace a její význam,

0:00:38.726,0:00:45.058
řekneme si něco o modelech replikace a enzymech katalyzujících tuto reakci.

0:00:45.058,0:00:50.957
Podrobně si pak vysvětlíme průběh tzv. semikonzervativní replikace.

0:00:54.023,0:00:58.955
Replikace DNA je proces tvorby kopií molekuly deoxyribonukleové kyseliny,

0:00:58.955,0:01:06.587
čímž se genetická informace přenáší z jedné molekuly DNA do jiné molekuly stejného typu.

0:01:06.587,0:01:12.786
Jedná se o proces, který předchází buněčnému dělení (mitóze nebo meióze)

0:01:12.786,0:01:22.184
a je základním předpokladem toho, že po rozdělení buňky získá každá z dceřiných buněk DNA typickou pro daný druh.

0:01:22.184,0:01:30.183
Během dělení musí buňka zkopírovat celý svůj genom, aby obě dceřiné buňky nesly stejnou informaci.

0:01:30.183,0:01:38.181
O navazujících dějích, kterými jsou transkripce a translace se dozvíte v dalších přednáškách.

0:01:41.514,0:01:47.379
O struktuře DNA jste již slyšeli v předchozí přednášce, tedy pouze krátce zopakuji,

0:01:47.379,0:01:58.377
že DNA je složena ze dvou komplementárních polynukleotidových vláken (neboli řetězců) stočených do šroubovice (neboli helixu).

0:01:58.377,0:02:05.876
Tato vlákna jsou vzájemně spojena vodíkovými můstky na základě komplementarity mezi bázemi nukleotidů,

0:02:05.876,0:02:11.075
kdy adenin je vždy spojen s thyminem a cytosin s guaninem.

0:02:11.075,0:02:19.073
Komplementarita je základním předpokladem toho, že nově syntetizovaný řetězec bude odpovídat původnímu.

0:02:19.073,0:02:25.605
Na každém z vláken rozlišujeme tzv. 3´a 5´ konec.

0:02:25.605,0:02:38.602
Řetězce jsou navzájem orientované antiparalelně, což znamená, že proti 5´konci jednoho řetězce leží 3´konec řetězce druhého a naopak.

0:02:42.335,0:02:53.633
Replikace DNA probíhá tzv. semikonzervativně, což znamená, že každá nově vzniklá molekula se skládá z jednoho řetězce původní molekuly DNA,

0:02:53.633,0:03:01.864
tzv. templátu a jednoho řetězce nově dosyntetizovaného na základě komplementarity bazí.

0:03:01.864,0:03:09.030
Jako templát, neboli matrice, mohou sloužit obě vlákna původní molekuly DNA.

0:03:09.030,0:03:19.261
V minulosti byl navrhován i tzv. konzervativní model replikace, ve kterém obě vlákna dceřiné DNA jsou nově syntetizována

0:03:19.261,0:03:25.460
a obě templátová vlákna rodičovské molekuly jsou ponechána v původním složení.

0:03:25.460,0:03:33.458
Tento model už je ale v současné době překonán podobně jako model tzv. disperzní replikace,

0:03:33.458,0:03:42.656
která produkuje dvě šroubovice, ve kterých každé vlákno obsahuje střídající se segmenty staré a nové DNA.

0:03:45.089,0:03:48.222
Replikace je katalyzována řadou enzymů.

0:03:48.222,0:04:01.219
Jsou to především DNA polymerázy, které katalyzují na matricovém řetězci DNA syntézu komplementárního vlákna DNA z deoxyribonukleotidů.

0:04:01.219,0:04:06.218
Tato schopnost se nazývá endonukleázová aktivita.

0:04:06.218,0:04:14.217
Polymerace probíhá vždy ve směru od 5´konce k 3´konci.

0:04:14.217,0:04:26.881
Pro svoji činnost potřebují DNA polymerázy krátký oligonukleotid, tzv. primer, od jehož 3´konce je zahájena syntéza.

0:04:26.881,0:04:37.112
Některé polymerázy mají i exonukleázovou aktivitu, což znamená, že odstraňují nukleotidy z konce dceřiného vlákna.

0:04:37.112,0:04:50.110
Exonukleázová aktivita je nutná pro odstranění RNA primerů využívaných při replikaci DNA a nazývá se proof-reading neboli kontrolní aktivita.

0:04:50.110,0:04:55.109
Je důležitá i v případech zařazení nesprávného nukleotidu,

0:04:55.109,0:05:02.641
kdy umožňuje návrat o krok zpět a opravu - zařazení správné (komplementární) báze.

0:05:02.641,0:05:11.206
Proof-reading aktivita tedy snižuje frekvenci spontánních mutací zapříčiněných chybovostí DNA-polymerázy,

0:05:11.206,0:05:18.537
která je odhadována na průměrně jednu chybu na 10 na sedmou zreplikovaných párů bazí.

0:05:19.870,0:05:25.203
U prokaryotických buněk jsou známé tři druhy DNA-polymeráz.

0:05:25.203,0:05:32.401
DNA polymeráza I má funkci polymerizační i exonukleázovou aktivitu.

0:05:32.401,0:05:41.699
DNA polymeráza II má exonukleázovou aktivitu a uplatňuje se při zakončení polymerace.

0:05:41.699,0:05:48.698
DNA polymeráza III je tzv. holoenzym, má 3 podjednotky s více funkcemi,

0:05:48.698,0:05:56.697
které se pro větší účinnost (neboli procesivitu) spojují do dimeru tvořeného dvakrát třemi podjednotkami.

0:05:56.697,0:06:04.395
S dalšími proteiny rozpozná komplex RNA primeru s matricovým řetězcem DNA.

0:06:04.395,0:06:10.394
Polymerizuje rychlostí přibližně 30 tis. nukleotidů za minutu.

0:06:12.393,0:06:18.159
Mezi další důležité enzymy v procesu replikace patří DNA helikázy,

0:06:18.159,0:06:26.824
které katalyzují odvíjení DNA řetězců šroubovice (neboli helixu) rušením vodíkových vazeb.

0:06:28.823,0:06:36.155
Dalším enzymem je primáza, která katalyzuje syntézu RNA primeru (oligoribonukleotidu),

0:06:36.155,0:06:42.821
od jehož 3´konce se syntetizuje krátký polydeoxyribunukleotid.

0:06:42.821,0:06:46.820
Tento komplex se nazývá Okazakiho fragment – bude vysvětleno později.

0:06:46.820,0:06:54.052
Dále pak DNA ligáza, která katalyzuje spojení polynukleotidů.

0:06:54.052,0:07:00.051
Uplatňuje se zejména při spojování Okazakiho fragmentů do souvislého řetězce.

0:07:02.683,0:07:08.449
Jak již bylo řečeno, replikace DNA probíhá tzv. semikonzervativním způsobem,

0:07:08.449,0:07:18.447
což znamená, že obě vlákna původní DNA mohou sloužit jako templáty pro syntézu nových (dceřiných vláken).

0:07:18.447,0:07:28.445
Nová DNA je tedy vždy tvořena jedním vláknem původním a jedním nově dosyntetizovaným na základě komplementarity bazí nukleotidů.

0:07:28.445,0:07:38.676
Platí, že DNA polymeráza se pohybuje podél templátového řetězce ve směru od 3´k 5´konci

0:07:38.676,0:07:47.675
a nová vlákna vznikají ve směru opačném, tedy od 5´k 3´konci.

0:07:51.974,0:07:57.273
Zde bych chtěla ještě jednou připomenout význam komplementárního párování bází,

0:07:57.273,0:08:06.004
které je nezbytně nutné k tomu, aby nově vnikající dceřiná DNA odpovídala původní, rodičovské.

0:08:06.004,0:08:13.469
Na schématu je vidět, že cytosin se váže vždy s guaninem a to třemi vodíkovými můstky,

0:08:13.469,0:08:18.468
zatímco adenin s thyminem dvěma vodíkovými můstky.

0:08:18.468,0:08:25.500
Tato komplementarita je základním předpokladem uchování a předání genetické informace.

0:08:28.167,0:08:32.499
Vlastní replikace začíná denaturací dvouvláknové DNA,

0:08:32.499,0:08:41.997
kdy iniciační proteiny, které se vážou na DNA, rozvíjejí její dvojšroubovicovou strukturu přerušením vodíkových můstků.

0:08:41.997,0:08:46.330
Místa, kde je struktura DNA nejdříve narušena,

0:08:46.330,0:08:55.328
se označují jako replikační počátky neboli ori místa (z anglického origin of replication)

0:08:55.328,0:08:59.660
a jsou určeny speciální nukleotidovou sekvencí.

0:08:59.660,0:09:08.359
Proces narušení dvoušroubovicové struktury DNA je katalyzován enzymem DNA helikázou.

0:09:10.358,0:09:17.890
Pro začátky replikace jsou typické útvary ve tvaru Y, které se nazývají replikační vidlice.

0:09:17.890,0:09:22.389
V jednom replikačním počátku se vytvoří dvě vidlice,

0:09:22.389,0:09:28.688
které se pohybují směrem od sebe, a proto je replikace označována jako obousměrná.

0:09:30.354,0:09:36.453
Jakmile jsou iniciační proteiny navázány na DNA a otevřou její dvojšroubovicovou strukturu,

0:09:36.453,0:09:45.451
váže se na replikační počátek skupina proteinů, které spolupracují při syntéze nového vlákna DNA.

0:09:45.451,0:09:53.583
Jedná se např. o tzv. SSB-proteiny (z anglického single-strand binding proteins),

0:09:53.583,0:10:01.415
které ochraňují jednořetězcovou DNA uvolněnou helikázou před opětovným spárováním.

0:10:02.415,0:10:11.679
Protože DNA-polymeráza (hlavní enzym katalyzující replikaci) nedokáže začít syntetizovat nové vlákno,

0:10:11.679,0:10:24.177
musí tedy existovat jiný enzym, který by dokázal spojit dva volné nukleotidy a začal tak syntetizovat nové vlákno podle jednořetězcové DNA.

0:10:24.177,0:10:33.008
Tento enzym se nazývá primáza a tvoří krátké úseky o délce přibližně deseti nukleotidů,

0:10:33.008,0:10:35.675
které jsou označovány jako primery.

0:10:35.675,0:10:49.172
Nejedná se však přímo o úseky DNA, ale o úseky podobné sloučeniny, označované jako ribonukleová kyselina, proto tzv. RNA primery.

0:10:49.172,0:10:58.537
Tyto RNA primery již mohou být prodlužovány DNA-polymerázou jako nový řetězec DNA.

0:10:58.537,0:11:06.668
Později jsou pak RNA primery díky exonukleázové aktivitě DNA-polymerázy odstraněny.

0:11:09.335,0:11:19.033
Jelikož může být DNA syntetizována pouze ve směru 5´- 3´, nastává v replikační vidlici určitý problém.

0:11:19.033,0:11:28.131
Vzhledem k tomu, že v původní dvojšroubovici jsou vlákna v opačné orientaci, je replikační vidlice asymetrická.

0:11:28.131,0:11:39.762
Jeden nový řetězec je v replikační vidlici syntetizován podle templátu ve směru 3' → 5'. (Vzniká 5' → 3' řetězec).

0:11:39.762,0:11:48.560
Druhý nový řetězec je v replikační vidlici syntetizován podle templátu ve směru 5' → 3'.

0:11:48.560,0:11:57.558
Neexistuje však DNA-polymeráza, která by dokázala prodlužovat 5' konec DNA.

0:11:57.558,0:12:07.223
Tudíž v tomto směru roste diskontinuálně tzn., že jsou ve směru 5' → 3' syntetizovány krátké úseky DNA

0:12:07.223,0:12:13.755
(tzv. Okazakiho fragmenty), které jsou následně spojovány v kontinuální řetězec.

0:12:13.755,0:12:19.621
Řetězec, který je tvořen kontinuálně, se nazývá vedoucí řetězec.

0:12:19.621,0:12:25.386
Řetězec, který je tvořen diskontinuálně, se nazývá opožďující se řetězec.

0:12:28.186,0:12:35.518
Opožďující se řetězec je tvořen mnoha oddělenými úseky DNA tzv. Okazakiho fragmenty.

0:12:35.518,0:12:42.216
Na vytvoření souvislého vlákna DNA z Okazakiho fragmentů jsou třeba tyto enzymy:

0:12:42.216,0:12:51.414
DNA-polymeráza I, která odstraňuje RNA-primery a nahrazuje RNA-primery DNA

0:12:51.414,0:12:57.013
a DNA-ligáza, která nakonec spojí všechny úseky dohromady.

0:12:58.013,0:13:06.011
Replikace prokaryotického chromozomu končí na specifických sekvencích, tzv. terminátorech replikace (TER),

0:13:06.011,0:13:15.676
na které se váže protein inhibující aktivitu helikázy a tím se zastaví tvorba replikační vidlice.

0:13:15.676,0:13:22.675
Replikace DNA u eukaryotních organizmů je podobná prokaryotům.

0:13:22.675,0:13:31.673
Je však složitější, například replikace na koncích lineárních molekul - telomer tvoří specifický problém,

0:13:31.673,0:13:36.672
který je řešen RNA obsahujícím enzymem telomerázou.

0:13:39.205,0:13:49.670
Zde je ještě jednou znázorněn model celého replizomu – rozvolněné DNA a proteinového aparátu v replikační vidlici.

0:13:52.669,0:13:57.335
Závěrem si shrneme nejdůležitější poznatky z této přednášky.

0:13:57.335,0:14:08.832
Replikace DNA se děje semikonzervativním mechanismem, kdy každý původní řetězec DNA slouží jako templát pro vznik nové molekuly.

0:14:08.832,0:14:18.297
Jedná se o proces katalyzovaný řadou enzymů, důležité je zapamatovat si především DNA-polymerázy.

0:14:18.297,0:14:25.696
Polymerace nového vlákna probíhá vždy pouze ve směru 5´- 3´.

0:14:25.696,0:14:34.527
DNA polymeráza potřebuje k zahájení syntézy krátké úseky, označované jako RNA primery.

0:14:34.527,0:14:43.825
Syntéza nového řetězce je na jednom templátovém vlákně kontinuální (jedná se o tzv. vedoucí řetězec)

0:14:43.825,0:14:54.290
a na druhém templátu diskontinuální s tvorbou tzv. Okazakiho fragmentů (jedná se o tzv. opožďující se řetězec).

0:14:54.290,0:15:03.288
U eukaryot k replikaci dochází v S-fázi buněčného dělení, začíná na mnoha místech.

0:15:03.288,0:15:13.020
Replikace je nezbytná pro uchování genetické informace a je podstatou dědičnosti na molekulární úrovni.

0:15:15.019,0:15:23.018
Já vám tedy tímto děkuji za pozornost a pokud máte nějaké otázky, můžete využít zde uvedený e-mail.