1
00:00:00,000 --> 00:00:12,176
Dobrý den. V přednášce se zaměříme na základy bezpečnosti potravin především ve spojení s GMO a popíšeme podstatu a význam GMO

2
00:00:12,176 --> 00:00:20,195
a klonování zvířat. Přednáška je součástí modulu 2: Konzervování a udržitelné využívání živočišných genetických zdrojů.

3
00:00:20,195 --> 00:00:27,620
Vytvoření této prezentace bylo podpořeno grantem ERASMUS+ KA2 v rámci projektu ISAGREED: 

4
00:00:27,620 --> 00:00:37,157
Inovace obsahu a struktury studijních programů v oblasti managmentu živočišných genetických a potravinových zdrojů s využitím digitalizace.

5
00:00:38,708 --> 00:00:45,671
Bezpečnost potravin je v současnosti jedno z nejdůležitějších témat ve spojení s chovem zvířat a produkcí potravin.

6
00:00:45,671 --> 00:00:52,172
Z tohoto hlediska je nutné sledovat potenciální výskyt škodlivých chemických látek, které mohou mít mutagenní 

7
00:00:52,172 --> 00:00:54,185
či dokonce kancerogenní povahu. 

8
00:00:54,185 --> 00:00:58,739
Zde se nejčastěji můžeme setkat s výskytem těžkých kovů a mykotoxinů. 

9
00:00:58,739 --> 00:01:04,283
V některých zemích se v mase mohou vyskytovat i antibiotika jako nežádoucí kontaminace. 

10
00:01:04,283 --> 00:01:10,685
Potraviny musí mít definované složení, aby se předešlo výskytu přirozeně se vyskytujících alergenů, 

11
00:01:10,685 --> 00:01:19,760
a v tomto případě je nutné na toto riziko konzumenty upozornit. Nejvážnější z hlediska zdravotního je mikrobiologická kontaminace,

12
00:01:19,760 --> 00:01:27,647
především u masa a mléčných výrobků bakteriemi jako jsou např. salmonelóza, listerióza či kampylobakterióza.

13
00:01:27,647 --> 00:01:37,415
Naštěstí je možné výskyt těchto alimentárních patogenů testovat mikrobiologickými kultivačními technikami, ale i pomocí DNA testů. 

14
00:01:37,415 --> 00:01:45,302
Ve spojení s výskytem GMO v potravinách se provádí při jejich schvalování důkladné testování jejich zdravotní nezávadnosti. 

15
00:01:45,302 --> 00:01:51,473
U GMO je potenciální riziko výskytu alergenů, proto i tyto je třeba testovat a detekovat. 

16
00:01:51,473 --> 00:02:00,779
Podobné mechanizmy ověřování zdravotní nezávadnosti je třeba aplikovat i u potenciálních potravin vyrobených z klonovaných zvířat.

17
00:02:01,538 --> 00:02:07,940
V současnosti musí být u potravin s obsahem GMO nad 0,9 % deklarována jejich přítomnost. 

18
00:02:07,940 --> 00:02:11,801
Za tímto účelem bylo vyvinuto několik citlivých detekčních metod. 

19
00:02:11,801 --> 00:02:20,513
Diagnostiku GMO v potravinách můžeme provést pomocí důkazu přítomnosti GMO a to přímou metodou identifikace transgenní DNA 

20
00:02:20,513 --> 00:02:29,588
(pomocí polymerázové řetězové reakce - PCR) nebo prokázání transgenní bílkoviny – imunochemicky metodou ELISA. 

21
00:02:29,588 --> 00:02:37,178
V případě použití PCR je-li přítomen ve vzorku DNA transgen, dochází k namnožení, neboli amplifikaci produktu, 

22
00:02:37,178 --> 00:02:42,161
který je viditelný jako proužek na elektroforetickém gelu.

23
00:02:43,052 --> 00:02:48,134
K určení podílu GMO v potravinách slouží tzv. kvantitativní metody.

24
00:02:48,134 --> 00:02:54,272
Nejcitlivější metodou je PCR v reálném čase, která je extrémně přesná a citlivá.

25
00:02:54,272 --> 00:03:01,928
Množství GMO ve vzorku se stanoví na základě porovnání křivky zkoumaného vzorku s křivkami standardů o známém složení.

26
00:03:01,928 --> 00:03:06,053
Metoda se též nazývá relativní kvantifikace.

27
00:03:07,076 --> 00:03:15,161
Z hlediska výsledku není rozdíl mezi tradičním šlechtěním a transgenozí, jako hlavní metodou tvorby geneticky modifikovaných organizmů. 

28
00:03:15,161 --> 00:03:20,771
Mají totiž stejný cíl, a to získat jedince s žádoucími alelami ve svých genotypech. 

29
00:03:20,771 --> 00:03:29,813
Při tradičním šlechtění se používá často hybridizace a záměrné připařování a je třeba mnoha generací než získáme žádoucí kombinace genotypů. 

30
00:03:29,813 --> 00:03:37,040
Transgenozi charakterizuje cílená a rychlá změna, přičemž je nutná znalost genu, který chceme použít a pomocí 

31
00:03:37,040 --> 00:03:43,838
vektoru ho přenést do organizmu, tzn. jeho struktury, funkce a sekvence.

32
00:03:43,838 --> 00:03:50,075
V tradičním šlechtění jde o práci v populaci, při transgenozi můžeme hovořit o šlechtění jedince. 

33
00:03:50,075 --> 00:03:53,771
Na schématu vidíme srovnání obou přístupů.

34
00:03:55,355 --> 00:04:03,209
Nejdříve si definujme genetickou modifikaci. Genetické modifikace jsou cílené zásahy do genetické informace. 

35
00:04:03,209 --> 00:04:12,119
I když výsledek může být podobný, tak náhodné zásahy působením mutagenů nebo ionizujícího záření (tvorba odrůd pšenice, řepky…) 

36
00:04:12,119 --> 00:04:19,049
nejsou považovány za genetickou modifikaci. Mezi genetické modifikace patří záměrné změny aktivity genů, 

37
00:04:19,049 --> 00:04:31,160
změny „místa působení“ (v jaké tkáni), záměna genu za jinou variantu, vyblokování genů a zejména pak vnášení cizích genů – transgenoze. 

38
00:04:31,160 --> 00:04:40,103
Klasickým příkladem transgenoze je u rostlin využívání bakterie Agrobacterium tumefaciens, která má přirozenou schopnost vnášet geny 

39
00:04:40,103 --> 00:04:47,660
např. pro odolnosti k herbicidům nebo pro produkci insekticidů – takto vznikla např. Bt-kukuřice. 

40
00:04:47,660 --> 00:04:55,613
Současně s rozvojem těchto biotechnologií vychází zákonné regulace, jako např. zákon o nakládání s GMO.

41
00:04:57,131 --> 00:05:01,487
Genetické modifikace jsou synonymem pro techniky rekombinantní DNA. 

42
00:05:01,487 --> 00:05:07,889
Jedná se o přímé a cílené zásahy do dědičného materiálu organismu (tzn. do DNA). 

43
00:05:07,889 --> 00:05:14,291
Nejznámější metodou je transgenoze, neboli přenos genu mezi druhy a vnášení jednotlivých genů do genomu 

44
00:05:14,291 --> 00:05:23,366
metodami genetického inženýrství. Geneticky modifikovaný organismus (GM organismus, GMO) je organismus (kromě člověka),

45
00:05:23,366 --> 00:05:30,361
jehož genetický materiál byl úmyslně změněn, a to způsobem, kterého se nedosáhne přirozenou rekombinací. 

46
00:05:30,361 --> 00:05:36,862
GMO mohou být mikroorganizmy, houby, rostliny nebo živočichové.

47
00:05:38,644 --> 00:05:44,914
Při tvorbě GMO vzniká řada problémů. Jedním z nich je nízká účinnost vkládání inzertů.

48
00:05:44,914 --> 00:05:51,118
Začlenění inzertu a jeho kopií probíhá často náhodně. 

49
00:05:51,118 --> 00:05:59,797
Produkt se může tvořit v nízké nebo vysoké koncentraci, protože je obtížné správně regulovat vyjádření, tj. expresi daného strukturního genu.

50
00:05:59,797 --> 00:06:05,176
Začlenění cizí DNA je často nestabilní a ve sledu generací se může vytratit. 

51
00:06:05,176 --> 00:06:10,720
Genové manipulace jsou stále nákladné a cíl bývá dosažen s velkou nejistotou. 

52
00:06:10,720 --> 00:06:18,970
Nejmodernější molekulární biotechnologie založené na systému CRISPR-CAS9 většinu těchto problémů pomáhají řešit.

53
00:06:21,313 --> 00:06:29,662
Podstatou procesu technologie rekombinantní DNA (využívaného v genetickém inženýrství) je využívání restrikčních enzymů, 

54
00:06:29,662 --> 00:06:36,361
které pochází z bakterií a slouží jako obranný mechanizmus proti cizorodé DNA, a které dokážou štěpit DNA 

55
00:06:36,361 --> 00:06:45,139
ve specifickém místě označovaném jako restrikční místo. Použitím stejného enzymu pro otevření vektoru i tvorbu obou konců genu 

56
00:06:45,139 --> 00:06:51,970
lze zvýšit pravděpodobnost správného vložení genu do plazmidu, k tomuto spojení se využívá enzym DNA - ligáza. 

57
00:06:51,970 --> 00:06:58,207
Tento proces spojování původně nesourodých úseků DNA nazýváme rekombinace DNA.

58
00:06:58,207 --> 00:07:05,401
Vektor se pak může začlenit do genomu hostitelské buňky a tím se přenese i vlastní sekvence genu.

59
00:07:08,173 --> 00:07:14,278
Základním problémem při transgenozi je, jak účinně vpravit rekombinantní DNA do buňky a jádra. 

60
00:07:14,278 --> 00:07:18,964
Je vyvinuto mnoho metod, z nichž nejprve uvádím tzv. biologické metody. 

61
00:07:18,964 --> 00:07:28,732
Lipofekce probíhá s pomocí lipidových micel, které enkapsulují nukleové kyseliny do lipozomů - a ty se mohou přirozeně dostat až do jádra buňky. 

62
00:07:28,732 --> 00:07:34,870
Transfekce pomocí plazmidových vektorů je poměrně jednoduchá metoda, ale s nízkým účinkem. 

63
00:07:34,870 --> 00:07:42,592
U zvířat se dnes využívá častěji virových vektorů, které mají přirozenou schopnost průniku do buňky a jádra. 

64
00:07:42,592 --> 00:07:51,535
V případě adenovirů DNA proniká do chromatinu, nikoliv přímo do DNA, v případě retrovirů a lentivirů se pak cizorodá DNA integruje 

65
00:07:51,535 --> 00:08:00,544
přímo do genomu. Na obrázku vpravo vidíme schéma lentiviru, který kromě RNA obsahuje enzymy pro integraci nukleové kyseliny do DNA 

66
00:08:00,544 --> 00:08:10,873
hostitele. Při transgenozi se dbá na to, aby virové vektory byly bezpečné, jsou upraveny tak, aby nebyly schopné reprodukce v hostitelské buňce.

67
00:08:12,589 --> 00:08:20,377
Fyzikální metody zahrnují především mikroinjekci, tj. vnesení DNA do oplozeného vajíčka nebo do embryonálních kmenových buněk, 

68
00:08:20,377 --> 00:08:27,934
metoda je to nenáročná a cizí geny se exprimují účinně. Metodu nelze využít v pozdějším vývojovém stádiu, 

69
00:08:27,934 --> 00:08:36,547
nevýhodou je nízká úspěšnost a náhodné začleňování insertu. Přenos genů pomocí embryonálních kmenových buněk tzv. ESC 

70
00:08:36,547 --> 00:08:44,698
je specializovaná metoda, kdy pluripotentní buňky blastocysty s in vitro vloženou DNA se vkládají do cizího embrya

71
00:08:44,698 --> 00:08:56,611
 a to pak do dělohy náhradní matky. Výsledkem je narození mláděte, které je genetickou chimérou, tzn. některé tkáně má s transgenem a jiné nikoliv. 

72
00:08:58,030 --> 00:09:05,851
Dalšími metodami je přenos DNA přes různé částice a jejich nastřelování do buňky, dále elektroporace 

73
00:09:05,851 --> 00:09:08,821
(tj. tvorba pórů v buňce pomocí elektrických impulzů). 

74
00:09:09,778 --> 00:09:19,777
Lze též využít tepelného šoku nebo obalených magnetických částic. Všechny tyto metody mají ale relativně nízkou účinnost (do 5 %)

75
00:09:19,777 --> 00:09:25,321
a jejich použití záleží na konkrétním druhu zvířat a zkušenostech příslušné laboratoře.

76
00:09:27,664 --> 00:09:35,683
Na tomto schématu vidíme příklad techniky mikroinjekce, kterou se přenáší transgen, s cílem, aby se po začlenění transgen 

77
00:09:35,683 --> 00:09:42,514
exprimoval jen v mléčné žláze a produkt, tzn. protein byl tak snadno izolovatelný z transgenního mléka. 

78
00:09:42,514 --> 00:09:50,071
Takto upravená zvířata sloužící k produkci specifických transgenních proteinů nazýváme jako biofermentory.

79
00:09:50,071 --> 00:10:00,268
Různé způsoby využití mikroinjektáže vidíme na obrázcích zde. Může se použít injektáž do prvojádra těsně před splynutím jader

80
00:10:00,268 --> 00:10:04,525
a vznikem zygoty -výsledkem je kompletně transgenní jedinec. 

81
00:10:04,525 --> 00:10:11,455
Dalším přístupem je vkládání transgenu do embryonálních kmenových buněk a těch pak do hostitelské blastocysty. 

82
00:10:11,455 --> 00:10:19,045
Narodí se chiméry, které dále navzájem křížíme a v dalších generacích může být získán opět kompletně transgenní jedinec.

83
00:10:19,045 --> 00:10:25,117
Výhodou této metody je to, že můžeme embryonální kmenové buňky kultivovat a selektovat, což zvyšuje 

84
00:10:25,117 --> 00:10:27,196
pravděpodobnost úspěchu při transgenozi.

85
00:10:27,196 --> 00:10:34,522
Další často využívanou metodou je přenos jádra, kdy se DNA konstrukt vloží do kultivovaných somatických buněk 

86
00:10:34,522 --> 00:10:43,168
(většinou málo diferencovaných, např. fibroblastů), a poté se z nich odebere jádro, které se následně vloží do enukleovaného vajíčka. 

87
00:10:43,168 --> 00:10:50,527
Zygota je pak implantována do náhradní matky a může se narodit opět jedinec transgenní ve všech buňkách.

88
00:10:52,474 --> 00:11:00,294
A k čemu je vlastně tvorba GM zvířat dobrá? Nejvýznamnější využití geneticky modifikovaných zvířat vidím v oblasti faramaceutické výroby.

89
00:11:00,294 --> 00:11:06,300
Řada velmi důležitých léčiv, často pro léčbu dědičných onemocnění je proteinové povahy. 

90
00:11:06,300 --> 00:11:15,309
Proteiny jako složité látky nelze vyrábět chemickou výrobou, jako jednoduchá léčiva, ale musí docházet k syntéze v biologických systémech.

91
00:11:15,309 --> 00:11:22,107
Nejjednodušší je výroba léčiv pomocí mikroorganizmů, např. bakterií. Takto se již řadu let vyrábí inzulin. 

92
00:11:22,107 --> 00:11:30,621
Inzulin je ale poměrně jednoduchý protein a ty složitější, se specifickými posttranslačními modifikacemi bakterie vyrábět neumí. 

93
00:11:30,621 --> 00:11:39,465
Nezbývá než využít eukaryota – a to zvířata jako savce nebo ptáky. Jedním z mnoha příkladů výroby léčiva je získání lidského proteinu 

94
00:11:39,465 --> 00:11:47,781
sebelipáza alfa z vajec kura domácího. Ze savců se často k podobnému účelu využívají kozy nebo králíci. 

95
00:11:49,266 --> 00:11:55,140
Proteiny mají velmi rozmanité vlastnosti, které se dají využívat i jako materiály pro různé rozvinuté technologie. 

96
00:11:55,140 --> 00:12:04,974
Např. pavoučí protein je látka v poměru k objemu a hmotnosti asi 7x pevnější než kvalitní ocel a označuje se jako Biosteel. 

97
00:12:04,974 --> 00:12:10,881
Zdrojem jsou geneticky modifikované kozy tvořící tento protein ve svém mléce.

98
00:12:12,729 --> 00:12:20,682
Příkladů GM potraviny živočišného původu schválené ke konzumaci není mnoho. Známým příkladem je GM losos, 

99
00:12:20,682 --> 00:12:28,932
který roste 11x rychleji než běžně chovaný losos obecný. Schvalovací řízení ve spojených státech amerických bylo velmi komplikované 

100
00:12:28,932 --> 00:12:38,238
a trvalo celých 20 let. Aby nedošlo k úniku GM lososů do přírody dochází k chovu v izolovaných kádích.

101
00:12:41,439 --> 00:12:47,445
S transgenozí jsou spojeny také etické problémy. Je nový produkt akceptovatelný pro zákazníky? 

102
00:12:47,445 --> 00:12:55,563
Spotřebitelé v Evropě spíše nechtějí potraviny z GMO. V minulosti v souvislosti s prvními nezdařenými experimenty vznikla obava, 

103
00:12:55,563 --> 00:13:03,945
zda existuje riziko vzniku tumorů nebo neurodegenerativních onemocnění u transgenních zvířat v důsledku integrace nebo exprese transgenů. 

104
00:13:03,945 --> 00:13:12,261
Je logické, že postranní efekty v důsledku modifikujících genů nelze vždy vyloučit. Etickým problémem pro řadu lidí může být i to, 

105
00:13:12,261 --> 00:13:17,805
že lidé mohou mít benefity z transgenních zvířat, ačkoliv transgenní zvířata sama je nemají. 

106
00:13:17,805 --> 00:13:28,299
Každopádně je třeba zaručit, že GM nezpůsobuje zvířatům žádné újmy. Časté jsou obavy, že cizí geny ovlivňují hostitele 

107
00:13:28,299 --> 00:13:37,176
a zda nemůže vzniknout ohrožení pro ekologickou rovnováhu a diverzitu druhů. Chov GM zvířat je ale obvykle uzavřený,

108
00:13:37,176 --> 00:13:47,109
nicméně 100% záruka neexistuje. V současné době rychle se rozvíjející editace genomu jako metody způsobující specifické a jen malé změny v genomu 

109
00:13:47,109 --> 00:13:50,079
většinu potenciálních rizik eliminuje. 

110
00:13:50,673 --> 00:13:59,187
V každém případě ale veškeré GMO podléhají detailnímu ověření potenciálních rizik, bezpečnost by tedy měla být zaručena.

111
00:14:00,837 --> 00:14:08,394
A nyní několik slov ke klonování zvířat. Klonování v tomto slova smyslu je reprodukční technika pro tvorbu geneticky identických potomků. 

112
00:14:08,724 --> 00:14:12,750
Často se však využívá i pro techniky spojené s genetickou modifikací. 

113
00:14:12,750 --> 00:14:21,825
Mezi techniky klonování u savců patří mikrochirurgická disekce embrya, izolace a proliferace nebo agregace jednotlivých blastomer 

114
00:14:21,825 --> 00:14:29,316
a především přenos jádra, které může ale nemusí být modifikováno. Klonování u savců můžeme rozdělit na reprodukční, 

115
00:14:29,316 --> 00:14:35,355
kdy dochází k tvorbě nového geneticky identického jedince a terapeutické za účelem léčby. 

116
00:14:35,355 --> 00:14:42,219
První typ se týká výhradně zvířat, druhý naopak má velký potenciál v humánní medicíně.

117
00:14:43,638 --> 00:14:52,779
První úspěšné klonování savce z dospělé buňky realizoval prof. Wilmuta z Roslinského Institutu ve Skotsku, kdy se již v roce 1996

118
00:14:52,779 --> 00:15:01,194
narodila ovečka Dolly. Byla použita technika přenosu jádra fúzováním buněk. Dolly byla geneticky identická s ovcí, 

119
00:15:01,194 --> 00:15:08,619
z které bylo odebráno jádro ze somatické buňky epitelu mléčné žlázy. Zajímavostí je, že ovečka Dolly měla 3 matky: 

120
00:15:08,619 --> 00:15:15,285
první darovala genetickou informaci, druhá prázdné vajíčko a třetí donosila mládě.

121
00:15:17,727 --> 00:15:26,835
Ve spojení s klonováním savců se objevila řada problémů. U řady zvířat se objevilo nízké procento zabřezávání, vývojové vady – rané zmetání, 

122
00:15:26,835 --> 00:15:36,075
narození mrtvých potomků, časná úmrtí po narození, krátká životnost, obezita, malformace různých orgánů a špatná imunita. 

123
00:15:36,075 --> 00:15:42,774
Obecně panuje nepřijetí klonovaných zvířat chovateli – např. koně nejsou zařazováni do plemenných knih. 

124
00:15:42,774 --> 00:15:51,255
Vznikají legislativní a etické problémy. Co se týče potravinových produktů z klonovaných zvířat (neboli „klonované maso“) – 

125
00:15:51,255 --> 00:15:58,185
podle amerického úřadu pro kontrolu potravin a léčiv FDA je bez rizika konzumovat maso klonovaných zvířat. 

126
00:15:58,185 --> 00:16:06,534
Ekonomicky je však tento chov vzhledem k vysokým nákladům na klonování zatím vysoce neefektivní. Evropský úřad pro bezpečnost 

127
00:16:06,534 --> 00:16:15,345
potravin ESFA také prohlásil produkty živočišného původu z klonů za bezpečné, problém je s welfare příjemkyň a vlastních klonů.

128
00:16:18,249 --> 00:16:25,872
Dosud bylo naklonováno velké množství různých živočišných druhů, od modelových, jako myš a potkan, po většinu hospodářských zvířat. 

129
00:16:25,872 --> 00:16:30,689
Na obrázku je 6 klonů jedné klisny, na kterých majitel jezdil během koňského póla. 

130
00:16:30,689 --> 00:16:37,421
Na obrázku je zajímavé to, že i když klisny jsou vysoce podobné, nejsou z hlediska zbarvení identické. 

131
00:16:37,421 --> 00:16:42,899
Rozmístění a velikost barevných znaků v tomto případě není jednoznačně geneticky dané. 

132
00:16:42,899 --> 00:16:48,806
Dá se říci, že často se ve světě klonuje za peníze a pro zábavu či zviditelnění.

133
00:16:51,017 --> 00:16:57,188
Hlavní význam klonovacích technik vidím především v potenciálu pro tzv. terapeutické klonování, které by mohlo umožnit léčbu 

134
00:16:57,188 --> 00:17:03,392
dosud neléčitelných onemocnění. Mechanizmem této léčby je nahrazení poškozených buněk buňkami geneticky identickými 

135
00:17:03,392 --> 00:17:10,223
buňkám vlastního těla, případně s opravenou genetickou informací (v případě léčby genetických onemocnění). 

136
00:17:10,223 --> 00:17:16,163
Jako slibné se jeví využití embryonálních kmenových buněk a především indukovaných pluripotentních 

137
00:17:16,163 --> 00:17:22,037
kmenových buněk (IPSC) vytvořených přímo ze somatických buněk konkrétního pacienta.

138
00:17:24,611 --> 00:17:31,145
Na rozdíl od potravin z GMO jsou potraviny z klonovaných zvířat přijatelnější, neobsahují nic cizorodého. 

139
00:17:31,145 --> 00:17:37,976
Oba biotechnologické přístupy však vyžadují zlepšení postupů zejména s ohledem na welfare života takto vytvořených zvířat. 

140
00:17:37,976 --> 00:17:46,094
Spotřebitel, ale ani dokonalý laboratorní analyzátor rozdíly mezi těmito kusy nepozná.

141
00:17:47,744 --> 00:17:55,334
Problematika GMO a klonování zvířat patří ke kontroverzním tématům a názor na tyto techniky si musí udělat každý posluchač sám. 

142
00:17:55,334 --> 00:18:01,835
Snahou této krátké prezentace bylo přinést objektivní informace, které by pomohly tento názor vytvořit. 

143
00:18:02,825 --> 00:18:05,795
Děkuji všem za pozornost.