1
00:00:01,402 --> 00:00:03,925
Dobrý den v této přednášce
2
00:00:04,126 --> 00:00:06,970
určené pro studenty doktorského studia se
3
00:00:06,970 --> 00:00:09,373
zaměříme na možnosti hodnocení genetické
4
00:00:09,373 --> 00:00:12,297
diverzity a struktury populací
5
00:00:12,777 --> 00:00:15,541
pomocí mitochondriální DNA a
6
00:00:15,541 --> 00:00:17,304
jaderných mikrosatelitních markerů
7
00:00:17,864 --> 00:00:19,707
aplikované na včely nedonosné.
8
00:00:21,139 --> 00:00:23,943
Přednáška je součástí modulu 1 genetika
9
00:00:23,943 --> 00:00:26,266
zvířat. Vytvoření této
10
00:00:26,266 --> 00:00:28,629
prezentace bylo podpořeno grantem Erasmus
11
00:00:28,629 --> 00:00:31,273
+ KA2 projektu
12
00:00:31,273 --> 00:00:34,157
ISAGREED Inovace obsahu a
13
00:00:34,157 --> 00:00:36,520
struktury studijních programů v oblasti
14
00:00:36,520 --> 00:00:38,843
managementu živočišných, genetických a
15
00:00:38,843 --> 00:00:41,166
potravinových zdrojů s využitím
16
00:00:41,166 --> 00:00:42,007
digitalizace.
17
00:00:45,903 --> 00:00:48,827
Obsahem této přednášky bude téma jako
18
00:00:48,827 --> 00:00:50,589
získávání genetických dat,
19
00:00:51,350 --> 00:00:53,473
hodnocení genetické variability pomocí
20
00:00:53,473 --> 00:00:55,356
sekvencí DNA
21
00:00:56,507 --> 00:00:58,630
a hodnocení genetické variability pomocí
22
00:00:58,630 --> 00:01:00,713
jaderných STR nebo-li
23
00:01:00,713 --> 00:01:02,756
mikrosatelitních marketrů.
24
00:01:06,110 --> 00:01:08,073
Proč je důležitá genetická diverzita?
25
00:01:09,645 --> 00:01:12,289
Genetická diverzita je významná pro
26
00:01:12,289 --> 00:01:15,173
zdraví v populaci. Je to zásadní
27
00:01:15,173 --> 00:01:16,735
zdroj možnosti
28
00:01:17,696 --> 00:01:20,380
vytvářet toleranci nebo rezistenci k
29
00:01:20,380 --> 00:01:22,863
současným i budoucím nemocem, patogenům a
30
00:01:22,863 --> 00:01:25,847
predátorům. Současný
31
00:01:25,847 --> 00:01:27,690
stav v populacích včel
32
00:01:28,611 --> 00:01:30,534
lze přisoudit mimo jiné i ke snížení
33
00:01:30,534 --> 00:01:33,478
diverzity. Diverzita včel
34
00:01:33,478 --> 00:01:36,402
byla hodnocena morfologickými znaky,
35
00:01:37,123 --> 00:01:39,526
jako jsou parametry křídel, pigmentace a
36
00:01:39,526 --> 00:01:42,210
podobně. Nyní je
37
00:01:42,210 --> 00:01:44,493
popsáno na 31 poddruhů
38
00:01:45,094 --> 00:01:47,737
plemen či ras včely medonosné
39
00:01:47,777 --> 00:01:50,711
Apis meliffera. Pomocí
40
00:01:50,711 --> 00:01:52,794
analýz DNA a to hlavně
41
00:01:52,794 --> 00:01:55,438
mitochondriální, byly popsány
42
00:01:55,558 --> 00:01:58,362
evoluční linie, jako je západní
43
00:01:58,362 --> 00:02:01,126
mediteriální typ M, severní
44
00:02:01,126 --> 00:02:02,568
meditární tip C,
45
00:02:03,289 --> 00:02:05,452
africká linie A a
46
00:02:05,772 --> 00:02:08,646
orientální linie O. A jsou
47
00:02:08,646 --> 00:02:10,408
poznávány další a další.
48
00:02:13,743 --> 00:02:15,345
Genom včely medonosné byl již
49
00:02:15,345 --> 00:02:17,148
několikrát celkově osekvenován.
50
00:02:18,029 --> 00:02:20,352
Zde můžeme vidět jednotlivé chromozomy
51
00:02:21,273 --> 00:02:23,717
a zejména předposlední sloupec
52
00:02:23,717 --> 00:02:25,799
ukazuje velikost jednotlivých
53
00:02:25,960 --> 00:02:28,723
chromozomů v délce počtu páru
54
00:02:28,723 --> 00:02:29,204
bází.
55
00:02:31,397 --> 00:02:33,921
V genomu včely medonosné bylo celkem
56
00:02:33,921 --> 00:02:36,444
popsáno, nebo se odhaduje,
57
00:02:36,804 --> 00:02:37,565
že je celkem na
58
00:02:37,565 --> 00:02:40,449
12398 genů,
59
00:02:41,170 --> 00:02:44,054
z toho je 9935
60
00:02:44,054 --> 00:02:46,578
genů, které kódují proteiny
61
00:02:47,299 --> 00:02:50,143
a 2421 genů, které nekodují
62
00:02:50,143 --> 00:02:52,866
proteiny. To znamená, že kódují jiné RNA,
63
00:02:52,866 --> 00:02:55,750
jako transferové nebo ribozomální RNA,
64
00:02:56,602 --> 00:02:58,754
nebo ostatní malé jaderné RNA.
65
00:03:03,721 --> 00:03:06,405
Mitochondriální DNA je u živočišných
66
00:03:06,405 --> 00:03:08,728
druhů v rozsahu kolem
67
00:03:08,728 --> 00:03:10,931
16 až 20k bází.
68
00:03:12,333 --> 00:03:14,256
Mitochondriální genom včely medonosné
69
00:03:14,256 --> 00:03:16,459
západní má přibližně
70
00:03:16,459 --> 00:03:18,942
16500 párů bází.
71
00:03:20,464 --> 00:03:22,187
V referenčním genomu NC
72
00:03:22,187 --> 00:03:25,191
001566
73
00:03:25,191 --> 00:03:27,874
je mitochodnriální DNA o velikosti
74
00:03:27,874 --> 00:03:29,757
16343.
75
00:03:31,159 --> 00:03:33,842
Kompletním genomu mitochondrální DNA
76
00:03:33,842 --> 00:03:35,845
včely karnické
77
00:03:36,807 --> 00:03:37,968
má velikost
78
00:03:38,889 --> 00:03:41,453
16358 párů bazí.
79
00:03:44,848 --> 00:03:47,211
Mitochondrální DNA včely medonosné
80
00:03:47,491 --> 00:03:50,175
obsahuje 13 genů, které kódují
81
00:03:50,175 --> 00:03:52,748
proteiny. Dále obsahuje
82
00:03:52,748 --> 00:03:54,911
22 genů, které korují tRNA
83
00:03:55,672 --> 00:03:58,156
a 2 geny, které korují ribozomální RNA.
84
00:03:59,928 --> 00:04:02,492
Proo fylogenetické a fylogeografické
85
00:04:02,532 --> 00:04:04,935
analýzy se zejména
86
00:04:04,935 --> 00:04:07,739
využívají sekvence barkódingu,
87
00:04:08,059 --> 00:04:10,463
což je sekvence cytochromoxidázy 1.
88
00:04:10,463 --> 00:04:13,417
A takzvaná intergenová
89
00:04:13,417 --> 00:04:16,381
oblast zahrnující část genu pro
90
00:04:16,381 --> 00:04:18,824
tRNA leucin a
91
00:04:19,345 --> 00:04:20,747
cytochromoxidázu 2.
92
00:04:25,693 --> 00:04:27,776
Jakou variabilitu lze pozorovat?
93
00:04:28,717 --> 00:04:31,121
Na úrovni DNA existují
94
00:04:31,121 --> 00:04:33,804
molekulární genetické markery. V současné
95
00:04:33,804 --> 00:04:36,328
době se nejčastěji využívají bi alelické
96
00:04:36,328 --> 00:04:38,891
jednonukleotidové polymorfismy. Ty se
97
00:04:38,891 --> 00:04:40,894
mohou nacházet jak v kódujících tak v
98
00:04:40,894 --> 00:04:42,016
nekódujících oblastech.
99
00:04:44,429 --> 00:04:46,392
Dále se dají využívat
100
00:04:46,592 --> 00:04:49,476
informace o takzvaných inzercích a
101
00:04:49,476 --> 00:04:51,358
delecích. To znamená, kdy chybí nebo
102
00:04:51,358 --> 00:04:54,122
naopak přebývá nějaká báze,
103
00:04:54,883 --> 00:04:57,407
můžeme toto nazývat jako indel. Na
104
00:04:57,407 --> 00:05:00,291
obrázcích vpravo vidíte příklady.
105
00:05:00,371 --> 00:05:02,614
Nahoře je SNP marker
106
00:05:03,375 --> 00:05:06,299
a dole delece cytozinu v oblasti
107
00:05:06,299 --> 00:05:07,781
sekvence ACA.
108
00:05:11,536 --> 00:05:14,060
Po vyizolování DNA
109
00:05:14,060 --> 00:05:16,823
ze vzorku včely. A
110
00:05:16,823 --> 00:05:19,227
její amplifikaci konkrétního malého
111
00:05:19,227 --> 00:05:21,910
úseku jednoho z těch dvou námi
112
00:05:21,910 --> 00:05:22,872
zmiňovaných genů.
113
00:05:24,434 --> 00:05:26,997
Dojde k sekvenování v takzvaném
114
00:05:26,997 --> 00:05:29,721
sekvenátoru na základě kapilární
115
00:05:29,721 --> 00:05:32,605
elektroforézy. Výsledek sekvenování to
116
00:05:32,605 --> 00:05:34,808
znamená určení jednotlivých
117
00:05:34,808 --> 00:05:37,492
bází v dané sekvenci
118
00:05:37,972 --> 00:05:40,576
vidíme na obrázku. Jednotlivé
119
00:05:40,576 --> 00:05:43,179
píky jsou vyjádřeny
120
00:05:43,179 --> 00:05:45,943
barvami, kterými jsou určeny
121
00:05:45,943 --> 00:05:47,225
právě jednotlivé báze.
122
00:05:50,549 --> 00:05:53,513
Identifikaci podtypu, mitotypů
123
00:05:53,634 --> 00:05:56,197
nebo haplotypů v linii C
124
00:05:57,930 --> 00:06:00,573
jsme využívali 2 sekvence
125
00:06:00,573 --> 00:06:03,057
mitochondriální DNA, to je ta výše zmiňovaná, to
126
00:06:03,337 --> 00:06:05,940
je intergenový úsek oblasti
127
00:06:06,501 --> 00:06:08,985
COI - COII
128
00:06:08,985 --> 00:06:11,027
neboli tRNA leucin cytochromoxidáza 2.
129
00:06:12,379 --> 00:06:13,741
Tento úsek se skládá ze dvou
130
00:06:13,741 --> 00:06:15,944
mitochondriálních genů, transferové RNA
131
00:06:15,944 --> 00:06:18,428
pro leucin a podjednotku cytochrom
132
00:06:18,428 --> 00:06:21,352
oxidázy 2. Tento fragment
133
00:06:21,352 --> 00:06:23,675
je typický vysokým obsahem
134
00:06:23,875 --> 00:06:26,839
množství AT dvojic a
135
00:06:26,839 --> 00:06:29,122
vykazuje významné rozdíly v délce a
136
00:06:29,122 --> 00:06:31,525
složení nukleotidů mezi populacemi včely
137
00:06:31,525 --> 00:06:34,289
medonosné. Tento amplikon se
138
00:06:34,289 --> 00:06:36,452
štěpí restrikční endonukleázou DraI,
139
00:06:36,452 --> 00:06:38,855
která specificky rozpoznává
140
00:06:38,855 --> 00:06:41,339
sekvencí TTTAAA,
141
00:06:41,940 --> 00:06:44,143
aby se mohla určit každá linie.
142
00:06:45,304 --> 00:06:48,148
Druhou sekvencí je sekvence pro
143
00:06:48,148 --> 00:06:50,191
oblast barkódingu a ta je
144
00:06:50,191 --> 00:06:51,913
součástí genu
145
00:06:51,913 --> 00:06:54,597
cytochromoxidázy 1, cox1.
146
00:06:55,719 --> 00:06:58,122
Tato sekvence se porovnává se
147
00:06:58,122 --> 00:07:00,685
sekvencemi uloženými v databázích, jako
148
00:07:00,685 --> 00:07:03,569
je BOLT systém nebo GenBank. Tento
149
00:07:03,569 --> 00:07:05,532
fragment DNA je v rámci taxonu vysoce
150
00:07:05,532 --> 00:07:08,136
konzervovaný a často se právě používá k
151
00:07:08,136 --> 00:07:10,699
rozlišení taxonu, jednotlivých druhů.
152
00:07:13,713 --> 00:07:16,357
Podle struktury v sekvenci
153
00:07:16,357 --> 00:07:19,080
tRNA leucin - cox2 lze určit
154
00:07:19,080 --> 00:07:21,884
jednotlivé evoluční linie u včely
155
00:07:21,884 --> 00:07:24,658
medonosné. Linie C,
156
00:07:24,658 --> 00:07:27,382
kam patří právě naše včela
157
00:07:27,382 --> 00:07:29,745
karnická, ale taky včela
158
00:07:29,745 --> 00:07:32,709
ligustika, macedonica a
159
00:07:32,709 --> 00:07:35,233
další, obsahují
160
00:07:35,433 --> 00:07:37,716
pouze jednu kopii
161
00:07:38,117 --> 00:07:39,759
takzvané Q sekvence.
162
00:07:41,812 --> 00:07:44,696
A linie obsahují jednu
163
00:07:44,696 --> 00:07:47,059
až dvě kopie této
164
00:07:47,059 --> 00:07:49,782
sekvence a navíc ještě takzvaný úsek
165
00:07:50,063 --> 00:07:52,436
P0. M linie,
166
00:07:52,436 --> 00:07:55,360
to je ta naše původní včela,
167
00:07:56,041 --> 00:07:58,484
Apis meliffera meliffera, která už se v
168
00:07:58,484 --> 00:08:01,168
České republice vlastně ani nevyskytuje,
169
00:08:01,689 --> 00:08:04,613
tak může obsahovat 1, 2 až 3 sekvence
170
00:08:04,853 --> 00:08:07,737
Q opakování a navíc takzvanou
171
00:08:07,737 --> 00:08:10,321
P sekvenci. A
172
00:08:10,321 --> 00:08:13,004
díky sekvenování a porovnání
173
00:08:13,004 --> 00:08:15,207
jednotlivých sekvencí můžeme
174
00:08:15,207 --> 00:08:17,450
identifikovat u každé včely,
175
00:08:18,091 --> 00:08:20,855
do jaké evoluční linie patří.
176
00:08:23,719 --> 00:08:26,362
Identifikovat konkrétní linii
177
00:08:26,523 --> 00:08:28,926
je možné právě pomocí štěpení restričním
178
00:08:28,926 --> 00:08:30,568
enzymem DraI,
179
00:08:31,610 --> 00:08:34,494
které rozpoznává tu změnu sekvencí TTT
180
00:08:34,574 --> 00:08:37,538
AAA. Jakoukoliv
181
00:08:37,538 --> 00:08:40,342
odchylku v důsledku nějaké mutace v této
182
00:08:40,342 --> 00:08:43,226
sekvenci tento enzym tuto sekvenci
183
00:08:43,226 --> 00:08:45,829
nerozpozná. Místo nemůže štěpit
184
00:08:46,310 --> 00:08:49,234
a pomocí klasické PCR reakce
185
00:08:49,554 --> 00:08:52,518
pomocí délky jednotlivých fragmentů lze
186
00:08:52,518 --> 00:08:54,481
od sebe odlišit jednotlivé varianty,
187
00:08:56,474 --> 00:08:58,797
jako je C a A,
188
00:08:59,438 --> 00:09:00,679
případně A4.
189
00:09:04,915 --> 00:09:07,759
Druhou možností je získat celou
190
00:09:07,759 --> 00:09:10,483
sekvenci daného úseku pomocí
191
00:09:10,483 --> 00:09:12,646
sekvenování, a to následně
192
00:09:12,646 --> 00:09:15,249
analyzovat. Zde vidíte příklad
193
00:09:15,530 --> 00:09:18,414
sekvencí tRNA leucin cox2
194
00:09:18,414 --> 00:09:20,336
u několika jedinců.
195
00:09:23,390 --> 00:09:25,634
Některé programy, jako jako například
196
00:09:25,634 --> 00:09:28,317
Unipro UGENE umožňují provést
197
00:09:28,638 --> 00:09:31,241
štěpení restriktázou DraI in
198
00:09:31,241 --> 00:09:33,244
silico, to znamená v počítači.
199
00:09:34,255 --> 00:09:37,179
Tady máme příklad jedné sekvence, která patří
200
00:09:37,179 --> 00:09:39,983
do C linie, neboť obsahuje právě tyto
201
00:09:39,983 --> 00:09:41,665
tři štěpná místa
202
00:09:43,067 --> 00:09:45,511
a vytváří nám vlastně 3 fragmenty o
203
00:09:45,511 --> 00:09:46,632
specifických délkách.
204
00:09:49,727 --> 00:09:52,410
U jiného vzorku nebylo nalezeno
205
00:09:52,410 --> 00:09:55,364
jedno štěpné místo. A podle délky
206
00:09:55,364 --> 00:09:58,328
fragmentů lze potom usoudit, že se
207
00:09:58,328 --> 00:10:01,212
jedná o včelu, která patří do linie
208
00:10:01,212 --> 00:10:02,534
A čili do africké.
209
00:10:06,900 --> 00:10:09,864
Získané sekvence z větší populace se
210
00:10:09,864 --> 00:10:12,508
potom srovnávají pomocí takzvaného
211
00:10:12,508 --> 00:10:14,951
multiple sekvenčního aligmentu, čili
212
00:10:14,951 --> 00:10:16,794
takzvaného vícečetného sekvenčního
213
00:10:16,794 --> 00:10:19,357
přirovnání. Mohli bychom to dělat
214
00:10:19,357 --> 00:10:22,321
manuálně, ale byly vytvořeny programy
215
00:10:22,321 --> 00:10:24,564
s algoritmy, které si s tím snadněji
216
00:10:24,564 --> 00:10:27,088
poradí. Některé jsou online,
217
00:10:27,448 --> 00:10:29,571
jak jsou například na serverech
218
00:10:29,571 --> 00:10:32,295
Evropského bioinformatického institutu.
219
00:10:32,295 --> 00:10:34,778
Pro naše účely byl nejvhodnější Kalign.
220
00:10:35,940 --> 00:10:37,582
Existuje, ale i další nástroj jako
221
00:10:37,582 --> 00:10:40,065
Clustal Omega, MAFT a podobně.
222
00:10:41,107 --> 00:10:43,871
Existují rovněž i programy, které
223
00:10:43,871 --> 00:10:46,554
si stáhnete a instalujete a které
224
00:10:46,554 --> 00:10:48,517
vám tuto analýzu také mohu provést.
225
00:10:48,517 --> 00:10:50,880
Například programy MEGA nebo již
226
00:10:50,880 --> 00:10:52,683
zmíněný Unipro UGENE.
227
00:10:56,628 --> 00:10:59,552
Pro detekci polymorfismu DNA a
228
00:10:59,552 --> 00:11:02,316
haplotypů v obou oblastech mitochondriální DNA
229
00:11:02,636 --> 00:11:04,879
s využitím všech sekvencí z vícenásobného
230
00:11:04,879 --> 00:11:07,403
přirovnání sekvencí ve formátu FASTA
231
00:11:08,004 --> 00:11:09,806
byl použit program DnaSP.
232
00:11:12,189 --> 00:11:14,472
Dále jsme nukletidové substituce a
233
00:11:14,472 --> 00:11:16,555
inzerce-delece pro každý haplotyp
234
00:11:16,836 --> 00:11:19,399
porovnávali s pozicemi se
235
00:11:19,399 --> 00:11:22,083
sekvencemi bez primerů a
236
00:11:22,083 --> 00:11:23,244
referenčním genomem.
237
00:11:24,997 --> 00:11:27,721
K identifikaci specifických haplotypů v tRNA
238
00:11:27,721 --> 00:11:30,404
leucin-cox2 linií C a A
239
00:11:30,805 --> 00:11:32,928
byly dále vyhledány referenční sekvence se
240
00:11:32,928 --> 00:11:35,772
stoprocentní identitou pomocí nástroje
241
00:11:35,772 --> 00:11:38,455
BLAST lokálního párového
242
00:11:38,455 --> 00:11:41,139
alignmentu vůči sekvencím,
243
00:11:41,139 --> 00:11:44,023
které se nachází databázi Národního
244
00:11:44,023 --> 00:11:46,987
centra pro biotechnologické informace NCBI
245
00:11:47,748 --> 00:11:50,412
v americkém GenBanku.
246
00:11:52,014 --> 00:11:54,938
K ověření haplotypů cox1
247
00:11:54,938 --> 00:11:57,732
byl rovněž použít blast, ale
248
00:11:57,732 --> 00:12:00,535
také byla ověřena jejich sekvence pomocí
249
00:12:00,535 --> 00:12:01,657
databáze BOLT.
250
00:12:05,022 --> 00:12:06,824
Na základě zarovnání vícenásobného
251
00:12:06,824 --> 00:12:08,346
sekvenování pomocí Kalign,
252
00:12:09,908 --> 00:12:11,911
s nutností ještě dalšího ručního
253
00:12:11,911 --> 00:12:14,434
zpracování, jsme
254
00:12:14,434 --> 00:12:16,878
identifikovali celkem 13
255
00:12:16,878 --> 00:12:19,001
haplotypů,
256
00:12:19,001 --> 00:12:21,524
z nich tři patřily do A linie
257
00:12:22,966 --> 00:12:25,530
a ostatní do C linie.
258
00:12:26,932 --> 00:12:29,215
Nejčastější haplotyp byl c1a,
259
00:12:29,976 --> 00:12:32,219
o kterém se říká, že
260
00:12:32,219 --> 00:12:34,462
je typický pro
261
00:12:36,034 --> 00:12:37,676
Apis meliffera ligustica, takzvanou
262
00:12:37,676 --> 00:12:38,678
italskou včelu.
263
00:12:43,444 --> 00:12:45,607
V této tabulce můžeme vidět
264
00:12:45,767 --> 00:12:48,090
určení jednotlivých haplotypů
265
00:12:48,932 --> 00:12:51,335
do C a A linie podle
266
00:12:52,016 --> 00:12:54,740
štěpení DraI spektra, ale
267
00:12:54,740 --> 00:12:57,623
samozřejmě i v důsledku následného
268
00:12:57,623 --> 00:13:00,618
sekvenování. Jednotlivé haplotypy,
269
00:13:00,618 --> 00:13:02,380
jejich sekvence byly
270
00:13:02,380 --> 00:13:04,543
vloženy do GenBanku
271
00:13:06,155 --> 00:13:09,039
na serveru NCBI. Ve třetím
272
00:13:09,039 --> 00:13:11,643
sloupci můžete vidět právě
273
00:13:12,003 --> 00:13:13,806
ty naše referenční
274
00:13:13,806 --> 00:13:16,599
sekvence. Dále tam můžeme
275
00:13:16,599 --> 00:13:19,563
vidět počty a délky fragmentů,
276
00:13:19,563 --> 00:13:22,407
které vznikají štěpením, ve kterých je
277
00:13:22,407 --> 00:13:23,849
taky velká variabilita.
278
00:13:25,171 --> 00:13:27,935
A v posledních dvou sloupcích můžete vidět
279
00:13:28,656 --> 00:13:30,218
identifikaci
280
00:13:31,950 --> 00:13:33,232
porovnáním s jinými
281
00:13:33,232 --> 00:13:35,716
sekvencemi v databázi GenBank,
282
00:13:36,156 --> 00:13:38,119
kde jsme vybrali ty se stoprocentní
283
00:13:38,680 --> 00:13:40,963
shodností s našimi sekvencemi
284
00:13:41,764 --> 00:13:43,807
a všechny námi
285
00:13:43,807 --> 00:13:46,050
určené
286
00:13:46,290 --> 00:13:48,934
haplotypy patřící do C linie,
287
00:13:48,934 --> 00:13:51,697
byly popsány u Apis meliffera
288
00:13:51,737 --> 00:13:54,281
carnika. A ty tři
289
00:13:54,281 --> 00:13:56,965
africké hapotypy byly
290
00:13:56,965 --> 00:13:59,929
identifikovány s Apis meliffera iberica
291
00:13:59,969 --> 00:14:02,652
nebo iberiensis a u jedné jediná
292
00:14:02,773 --> 00:14:04,535
sekvenci, která měla
293
00:14:04,535 --> 00:14:07,259
stoprocentní shodu, to znamená ta A4,
294
00:14:07,259 --> 00:14:10,022
nebyla přisouzen
295
00:14:10,022 --> 00:14:12,105
žádný poddruh.
296
00:14:16,051 --> 00:14:18,334
A v této tabulce můžeme vidět
297
00:14:19,886 --> 00:14:22,009
určení na jednotlivých pozicích
298
00:14:22,009 --> 00:14:24,813
polymorních míst jaké báze
299
00:14:25,013 --> 00:14:27,056
se nacházely v jakém haplotypu.
300
00:14:30,170 --> 00:14:32,934
Máme tady celkem 10 pozic,
301
00:14:33,535 --> 00:14:36,419
v kterých byly zjištěny zejména SNP
302
00:14:36,419 --> 00:14:38,982
záměny, ale také
303
00:14:39,423 --> 00:14:40,184
delece.
304
00:14:42,917 --> 00:14:45,801
Zejména asi všimněte toho druhého polymorfismu
305
00:14:46,282 --> 00:14:48,966
na pozici 50, kde
306
00:14:49,567 --> 00:14:52,451
standardní alela je C v haplotypu C1a,
307
00:14:52,451 --> 00:14:55,375
ale ostatní haplotypy, které jsme my
308
00:14:55,375 --> 00:14:57,698
detekovali měly na této pozici deleci.
309
00:15:01,693 --> 00:15:04,257
Podobně jsme analyzovali i
310
00:15:04,257 --> 00:15:06,540
sekvenci cox1.
311
00:15:09,274 --> 00:15:11,517
Kde jsme nakonec nalezli 13 různých
312
00:15:11,517 --> 00:15:13,840
haplotypů pro barcoding.
313
00:15:16,063 --> 00:15:18,827
A opět zde vidíme jednotlivé SNP
314
00:15:18,987 --> 00:15:21,550
mutace. V barcodingové sekvenci se
315
00:15:21,550 --> 00:15:23,833
nevyskytovaly žádné inzerce-delace,
316
00:15:24,154 --> 00:15:26,757
pouze SNP substituce.
317
00:15:30,863 --> 00:15:33,507
V této tabulce následně vidíte
318
00:15:33,747 --> 00:15:36,270
výsledky určení
319
00:15:36,270 --> 00:15:39,194
frekvencí počtu a frekvencí výskytu
320
00:15:39,194 --> 00:15:41,808
haplotypů v
321
00:15:41,808 --> 00:15:44,572
genu tRNA leucímn - cox 2 a v genu cox1
322
00:15:44,572 --> 00:15:46,615
v České republice.
323
00:15:48,247 --> 00:15:50,330
Vidíme, že je tam celá řada haplotypů,
324
00:15:50,330 --> 00:15:52,853
které jsou relativně dobře zastoupeny,
325
00:15:53,134 --> 00:15:55,977
jako je c1a, c2l, c2e,
326
00:15:56,378 --> 00:15:59,022
c2a. Potom je tam celá řada
327
00:15:59,022 --> 00:16:01,585
haplotypů, které jsme nalezli pouze u 1
328
00:16:01,585 --> 00:16:03,628
jedince nebo několika málo jedinců.
329
00:16:05,230 --> 00:16:07,713
Podobná situace se nachází v
330
00:16:07,794 --> 00:16:09,836
sekvencích genu cox1,
331
00:16:09,836 --> 00:16:11,839
kde zase
332
00:16:11,839 --> 00:16:14,363
první čtyři haplotypy byly nejčastěji
333
00:16:14,363 --> 00:16:17,126
zastoupeny. A ostatní
334
00:16:17,126 --> 00:16:18,688
byli v menšině nebo
335
00:16:19,730 --> 00:16:21,332
individuálních vzorcích.
336
00:16:25,167 --> 00:16:26,689
Z populace včel medonosných
337
00:16:27,571 --> 00:16:30,535
v České republice z více než
338
00:16:30,535 --> 00:16:32,978
300 vzorků jsme následně spočítali
339
00:16:32,978 --> 00:16:35,662
některé charakteristiky jakožto parametry
340
00:16:35,662 --> 00:16:38,586
diverzity haplotypů, jak v tRNA
341
00:16:38,586 --> 00:16:41,309
leucin-cox2, tak cox1 sekvenci.
342
00:16:42,241 --> 00:16:44,644
Byly odhadnuty nebo spočítané haplotypová
343
00:16:44,644 --> 00:16:47,528
diverzita Hd, molekulární diverzita
344
00:16:47,528 --> 00:16:49,170
pí, a Tajimovo d.
345
00:16:51,063 --> 00:16:53,226
Tyto indexy genetické diverzity
346
00:16:54,067 --> 00:16:56,710
byly vyhodnoceny pomocí balíčku pegas v
347
00:16:56,710 --> 00:16:59,344
programu R. Ale mohou být
348
00:16:59,344 --> 00:17:01,627
využity také programy, jako je DnaSP
349
00:17:01,627 --> 00:17:03,710
MEGA nebo Arlequin.
350
00:17:06,564 --> 00:17:09,007
Dále jsme se snažili určit takzvané
351
00:17:09,007 --> 00:17:11,811
haplotypové sítě. Využili
352
00:17:11,811 --> 00:17:14,735
jsme metodu RMST rendomise minimum
353
00:17:14,735 --> 00:17:17,008
spanning tree, která
354
00:17:17,008 --> 00:17:19,211
zohledňuje frekvence
355
00:17:20,493 --> 00:17:23,217
a vztahy, to znamená rozdílnosti mezi
356
00:17:23,217 --> 00:17:24,498
jednotlivými haplotypy.
357
00:17:26,241 --> 00:17:28,404
Tyto tyto sítě
358
00:17:28,484 --> 00:17:31,448
haplotypu byly zase zpracovány v programu
359
00:17:31,448 --> 00:17:34,332
balíčkem pegas programu R.
360
00:17:34,332 --> 00:17:36,976
Mohou být ale použity i jiné programy,
361
00:17:36,976 --> 00:17:39,459
jako například PopART a další.
362
00:17:41,432 --> 00:17:43,755
Tady vidíme výsledek analýzy
363
00:17:43,755 --> 00:17:46,398
hapotypové sítě u 308
364
00:17:46,398 --> 00:17:49,082
jedinců v sekvenci tRNA
365
00:17:49,082 --> 00:17:51,646
leucin - cox2. Vidíme, že
366
00:17:51,646 --> 00:17:54,209
nejčastější haplotyp by opravdu ten c1a.
367
00:17:55,621 --> 00:17:58,024
Druh nejčastější je c2e,
368
00:17:58,705 --> 00:18:01,189
mezi nimiž ale jsou 2 bodové
369
00:18:01,189 --> 00:18:03,912
mutace, mezi těmito haplotypy
370
00:18:04,633 --> 00:18:06,316
a třetí
371
00:18:06,316 --> 00:18:09,119
nejčastější v České republice je
372
00:18:09,160 --> 00:18:11,823
c2c. Každá
373
00:18:11,823 --> 00:18:14,667
barva v té výseči představuje konkrétní
374
00:18:14,667 --> 00:18:17,271
kraj, v kterém byla ta
375
00:18:17,271 --> 00:18:18,833
včela získána.
376
00:18:20,054 --> 00:18:22,097
V našem pokusu byla
377
00:18:22,097 --> 00:18:24,741
pokryta celá Česká republika.
378
00:18:24,741 --> 00:18:26,623
Ze všech krajů bylo odebráno
379
00:18:26,623 --> 00:18:28,506
rovnoměrné množství vzorků.
380
00:18:31,470 --> 00:18:33,593
Na dalším slidu můžeme vidět analýzu
381
00:18:33,593 --> 00:18:36,277
haplotypové sítě u sekvencí
382
00:18:36,277 --> 00:18:39,161
cox1, kde opět
383
00:18:39,161 --> 00:18:41,804
vidíme, že pokud
384
00:18:42,004 --> 00:18:44,928
byl ten hapotyp dostatečně četný, tak
385
00:18:44,928 --> 00:18:47,011
se v podstatě vyskytoval téměř ve všech
386
00:18:47,011 --> 00:18:49,294
ve všech krajích. Týká se to HpB02,
387
00:18:49,334 --> 00:18:52,299
HpB03,
388
00:18:52,299 --> 00:18:55,062
HpB01, případně ještě HPB04.
389
00:18:55,062 --> 00:18:57,786
Ostatní haplotypy se
390
00:18:57,786 --> 00:19:00,750
zase vyskytovaly v jednotkách nebo jenom
391
00:19:00,750 --> 00:19:01,671
u 1 jedince.
392
00:19:06,348 --> 00:19:08,911
Dále byla provedena fylogenetická analýza
393
00:19:08,991 --> 00:19:11,355
na základě těchto sekvencí, to znamená po
394
00:19:11,355 --> 00:19:13,718
provedení MSA,
395
00:19:14,599 --> 00:19:16,802
vícečetného alignmentu
396
00:19:16,802 --> 00:19:19,325
sekvencí, jsme využili tvorbu
397
00:19:19,325 --> 00:19:21,889
fylogenetických stromů, a to
398
00:19:21,889 --> 00:19:24,733
zejména pomocí metody Maximum Likelihood a
399
00:19:24,933 --> 00:19:27,457
a Tamura-Nei modelu v programu MEGA X.
400
00:19:29,209 --> 00:19:32,053
Tato metoda je založena na tom,
401
00:19:32,053 --> 00:19:34,296
že se vytváří bootstrapový konsensuální
402
00:19:34,296 --> 00:19:36,980
strom na základě 10000
403
00:19:36,980 --> 00:19:39,924
replikátů. Jednotlivé
404
00:19:39,924 --> 00:19:42,447
větve odpovídají oddílům produkovaným v
405
00:19:42,447 --> 00:19:44,690
méně než 50 procentech boodstrapových
406
00:19:44,690 --> 00:19:47,023
replikátů. A procento
407
00:19:47,023 --> 00:19:48,706
replikačních stromů, v nichž se
408
00:19:48,706 --> 00:19:50,348
související haplotypy shlukovaly v
409
00:19:50,348 --> 00:19:52,871
bootstrepovém testu. Tyto
410
00:19:52,871 --> 00:19:55,275
informace jsou potom uvedeny ve vedle
411
00:19:55,275 --> 00:19:55,835
těch větví.
412
00:19:58,058 --> 00:20:00,382
Počáteční strom pro heuristické
413
00:20:00,382 --> 00:20:02,424
vyhledávání byl získán automaticky
414
00:20:02,424 --> 00:20:05,108
používám algoritmu, Neighbor-join a BioNJ
415
00:20:05,108 --> 00:20:07,992
na matici párových vzdáleností
416
00:20:07,992 --> 00:20:10,836
odhadnutých pomocí modelu Tamura-Nei a
417
00:20:10,836 --> 00:20:12,919
následným výběrem topologie s nejvyšší
418
00:20:12,919 --> 00:20:14,881
hodnotou logaritmické pravděpodobnosti.
419
00:20:16,263 --> 00:20:17,866
Ve výsledku jsme získali
420
00:20:18,987 --> 00:20:21,070
tyto fylogenetické stromy.
421
00:20:22,632 --> 00:20:25,236
Vlevo máme fylogenetický strom na základě
422
00:20:25,236 --> 00:20:27,479
analýzy sekvence tRNA leucin - cox2,
423
00:20:27,479 --> 00:20:30,363
vpravo fylogenetický strom
424
00:20:30,483 --> 00:20:32,806
na základě cox1 sekvencí.
425
00:20:33,727 --> 00:20:36,131
Můžeme vidět, že opravdu Africké
426
00:20:36,211 --> 00:20:39,055
včely nebo včely A linie
427
00:20:39,776 --> 00:20:40,737
se shlukují
428
00:20:41,858 --> 00:20:44,622
společně, na rozdíl od těch
429
00:20:44,622 --> 00:20:46,745
ostatních, to znamená těch včel
430
00:20:46,825 --> 00:20:49,549
linie C, které jsou zde označeny červeně.
431
00:20:53,444 --> 00:20:56,368
Druhým typem markerů, který jsme využívali pro
432
00:20:56,368 --> 00:20:58,651
hodnocení genetické variability, byly
433
00:20:58,651 --> 00:21:00,934
mikrosatelity. Jedná se o
434
00:21:00,934 --> 00:21:03,698
polymorfismy, které se výhradně vyskytují
435
00:21:04,219 --> 00:21:06,973
v jaderné DNA.
436
00:21:06,973 --> 00:21:08,134
A tyto polymorfismy jsou
437
00:21:08,134 --> 00:21:10,137
charakteristické
438
00:21:11,058 --> 00:21:13,582
tandemovými opakováními určitého
439
00:21:13,582 --> 00:21:16,546
motivu, jako například v tomto případě GC.
440
00:21:16,626 --> 00:21:19,510
A jako jednotlivá
441
00:21:19,510 --> 00:21:22,073
alela je označována ta konkrétní
442
00:21:22,073 --> 00:21:25,037
délka tohoto opakování. Takže
443
00:21:25,037 --> 00:21:27,641
máme nahoře alelu, která má 8 opakování
444
00:21:27,641 --> 00:21:30,245
uprostřed je alela sekvence, která má 3
445
00:21:30,245 --> 00:21:32,728
opakování a poslední
446
00:21:32,728 --> 00:21:35,251
třetí sekvence je alela, která je
447
00:21:35,251 --> 00:21:37,294
s 10 opakováními.
448
00:21:38,776 --> 00:21:40,739
Jako alela se potom označuje
449
00:21:40,979 --> 00:21:43,823
nějaká oblast, v které se
450
00:21:43,823 --> 00:21:46,387
tento mikrosatelit nachází, který je
451
00:21:46,387 --> 00:21:49,351
ohraničen primery.
452
00:21:49,511 --> 00:21:52,435
Pomocí sekvenátoru a fragmentační analýzy
453
00:21:52,715 --> 00:21:54,918
jsme schopni určit právě délku toho
454
00:21:54,918 --> 00:21:57,562
zeleného úseku, který obsahuje právě ten
455
00:21:57,562 --> 00:22:00,085
mikrosatelit. Dole na
456
00:22:00,085 --> 00:22:02,649
obrázku můžeme vidět
457
00:22:03,210 --> 00:22:05,733
určení genotypů pro
458
00:22:05,733 --> 00:22:07,015
konkrétní daný
459
00:22:07,816 --> 00:22:08,937
mikrosatelit,
460
00:22:10,830 --> 00:22:13,273
který je v tomto případě dán třemi
461
00:22:13,273 --> 00:22:15,747
alelami. Ty jsou
462
00:22:15,747 --> 00:22:17,429
charakterizované čísly
463
00:22:17,429 --> 00:22:19,752
156 152 a
464
00:22:19,752 --> 00:22:22,636
140. Vidíme, že
465
00:22:22,636 --> 00:22:24,839
mikrosatelity jsou velmi
466
00:22:24,839 --> 00:22:27,723
polymorfní, nemusí mít pouze 3
467
00:22:27,723 --> 00:22:30,687
alely. Mohou mít klidně i 20 alel a tím
468
00:22:30,687 --> 00:22:32,730
pádem v populaci může být velké množství
469
00:22:32,730 --> 00:22:35,694
různých kombinací v genotypech a jsou
470
00:22:35,694 --> 00:22:37,737
tedy výhodné pro
471
00:22:37,817 --> 00:22:40,501
hodnocení diverzity v
472
00:22:40,501 --> 00:22:41,141
populacích.
473
00:22:45,447 --> 00:22:47,330
Zde vidíme příklad variability ve dvou
474
00:22:47,330 --> 00:22:49,974
populacích. Populace vlevo
475
00:22:50,454 --> 00:22:53,178
je málo variabilní, obsahuje
476
00:22:53,178 --> 00:22:54,940
pouze 3 typy alel
477
00:22:56,242 --> 00:22:58,485
a velké množství homozygotních lokusů.
478
00:22:59,487 --> 00:23:02,210
Druhá populace vpravo obsahuje
479
00:23:02,210 --> 00:23:05,094
velké množství alal a častěji se tam tím
480
00:23:05,094 --> 00:23:07,337
pádem mohou vyskytovat heterozygotní
481
00:23:07,417 --> 00:23:08,138
genotypy.
482
00:23:12,344 --> 00:23:14,187
Proč se pořád využívají mikrosatelitní
483
00:23:14,187 --> 00:23:16,910
lokusy, když máme již celogenové
484
00:23:16,910 --> 00:23:19,434
sekvence? Mikrosatelitní
485
00:23:19,434 --> 00:23:21,677
lokusy jsou relativně cenově
486
00:23:21,677 --> 00:23:23,560
dostupné pro jejich identifikace.
487
00:23:25,132 --> 00:23:28,096
Jsou multilusovou genotypovou informací
488
00:23:28,096 --> 00:23:30,940
co nám zachycují a lze je tím pádem snadno
489
00:23:30,940 --> 00:23:33,223
využívat k odhadu genetických diverzit
490
00:23:33,223 --> 00:23:35,866
populačních struktur a tím pádem
491
00:23:35,866 --> 00:23:38,069
využívat je i v konzervační genetice v
492
00:23:38,310 --> 00:23:41,063
případném šlechtění celé škály
493
00:23:41,424 --> 00:23:42,265
organismů.
494
00:23:45,620 --> 00:23:48,383
Pro učení genotypů se výhradně
495
00:23:48,383 --> 00:23:50,867
využívá takzvaná fragmentační analýza.
496
00:23:52,079 --> 00:23:54,842
Která se provádí v sekvenátorech
497
00:23:55,403 --> 00:23:57,406
s kapilární
498
00:23:57,406 --> 00:23:58,367
elektroforézou.
499
00:24:00,019 --> 00:24:02,262
Fragmenty se dělí podle své velikosti.
500
00:24:02,823 --> 00:24:05,307
Snímač potom detekuje průchody molekul
501
00:24:05,947 --> 00:24:08,471
a barvu a intenzitu signálu
502
00:24:08,831 --> 00:24:11,745
v určitém čase.
503
00:24:12,186 --> 00:24:14,549
A dochází k získávání informací o
504
00:24:14,549 --> 00:24:16,552
těch délkách jednotlivých fragmentů.
505
00:24:18,314 --> 00:24:20,117
Přístroj, který se využívá
506
00:24:20,117 --> 00:24:21,799
je genetický analyzátor.
507
00:24:24,733 --> 00:24:26,696
V našem případě jsme využívali genetický
508
00:24:26,696 --> 00:24:28,538
analyzátor ABI PRISM 3500.
509
00:24:28,538 --> 00:24:31,532
Velikost fragmentu
510
00:24:31,532 --> 00:24:34,497
byl přesně stavent pomocí následného
511
00:24:34,617 --> 00:24:36,940
softwaru GeneScan a
512
00:24:36,940 --> 00:24:39,784
vyhodnocen, to znamená určení genotypu
513
00:24:39,784 --> 00:24:41,426
pomocí softwaru GeneMapper.
514
00:24:43,188 --> 00:24:45,752
Potom jsme sledovali 22
515
00:24:45,752 --> 00:24:47,634
lokusů mikrosatelitů.
516
00:24:48,556 --> 00:24:50,999
Využili jsme možnost seskupit
517
00:24:50,999 --> 00:24:53,923
určité mikrosatelity do jedné
518
00:24:53,923 --> 00:24:56,727
multiplexní
519
00:24:56,727 --> 00:24:59,411
reakce. Zde
520
00:24:59,411 --> 00:25:01,974
máme několik mikrosatelitů,
521
00:25:01,974 --> 00:25:04,658
které za shodných podmínek pomocí
522
00:25:04,658 --> 00:25:07,101
různých barviček můžeme jejich
523
00:25:07,422 --> 00:25:08,783
fragmenty identifikovat.
524
00:25:10,466 --> 00:25:12,789
Výsledkem analýzy je toto
525
00:25:13,109 --> 00:25:15,433
zobrazení, kdy vidíme
526
00:25:17,305 --> 00:25:19,708
pro konkrétní mikrosatelitní locus
527
00:25:20,029 --> 00:25:22,672
označený konkrétní barvičkou jeho
528
00:25:22,712 --> 00:25:25,356
píky, to znamená identifikované
529
00:25:26,898 --> 00:25:29,542
fragmenty o specifické délce.
530
00:25:34,789 --> 00:25:37,473
Na tomto obrázku můžeme vidět vyhodnocení
531
00:25:38,234 --> 00:25:40,236
variability, určení genotypů,
532
00:25:40,236 --> 00:25:42,720
mikrosabilitních lokusů u tří jedinců.
533
00:25:44,072 --> 00:25:46,195
Vidíme, že opravdu se mezi sebou na
534
00:25:46,195 --> 00:25:48,758
daných pozicích v dané oblasti
535
00:25:49,159 --> 00:25:51,922
mohou vyskytovat různé alely a tím
536
00:25:51,922 --> 00:25:54,486
pádem velice snadno můžeme odlišovat i
537
00:25:54,486 --> 00:25:55,647
jedince mezi sebou.
538
00:25:58,932 --> 00:26:01,415
Po určení genotypů ve všech pokusech a u
539
00:26:01,415 --> 00:26:03,218
všech jedinců v populaci.
540
00:26:04,339 --> 00:26:07,223
Může následovat analýza diverzity,
541
00:26:07,223 --> 00:26:10,187
to znamená určení diverzitních
542
00:26:10,187 --> 00:26:12,711
parametrů, které se používají, a to je
543
00:26:12,711 --> 00:26:15,354
počet alel, efektivní počet alel,
544
00:26:15,915 --> 00:26:18,479
Shanonův informační index, pozorovaná a
545
00:26:18,599 --> 00:26:21,082
očekávaná heterozygotnost, a
546
00:26:21,523 --> 00:26:24,287
nevychýlená očekávaná heterozygnost a
547
00:26:24,287 --> 00:26:25,809
takzvaný fixační index.
548
00:26:27,050 --> 00:26:29,334
My jsme využili program GenAlEx,
549
00:26:29,854 --> 00:26:32,698
který funguje pod Microsoft
550
00:26:32,698 --> 00:26:35,582
Excelem. Ale můžou být tato
551
00:26:35,582 --> 00:26:37,465
data, tyto parametry
552
00:26:37,585 --> 00:26:39,988
vypočítány i pomocí balíčku
553
00:26:39,988 --> 00:26:41,991
diveRzity programu R.
554
00:26:44,534 --> 00:26:45,896
Vidíme, že.
555
00:26:47,558 --> 00:26:49,561
očekávaná heterozygnost
556
00:26:50,322 --> 00:26:52,645
průměrná za všechny lokusy je
557
00:26:52,645 --> 00:26:54,208
0,579
558
00:26:54,208 --> 00:26:56,851
a skutečná
559
00:26:57,011 --> 00:26:59,975
pozorovaná heterozygnost má hodnotu
560
00:26:59,975 --> 00:27:01,778
0,556.
561
00:27:03,100 --> 00:27:05,864
Je to teda relativně dostatečná
562
00:27:05,864 --> 00:27:08,147
heterozygotnost, která se v populaci včel
563
00:27:08,427 --> 00:27:10,910
vyskytuje a je možné tuto
564
00:27:10,910 --> 00:27:13,314
populaci charakterizovat jako
565
00:27:13,314 --> 00:27:15,357
dostatečně diverzitní.
566
00:27:20,413 --> 00:27:23,337
Protože jsme u každého jedince věděli, v
567
00:27:23,337 --> 00:27:25,821
jaké oblasti České republiky byl
568
00:27:25,821 --> 00:27:28,815
odebrán, rozdělili
569
00:27:28,815 --> 00:27:31,018
jsme populaci
570
00:27:31,979 --> 00:27:34,262
do
571
00:27:34,262 --> 00:27:35,985
77 okresů,
572
00:27:37,347 --> 00:27:38,829
které nám charakterizovaly
573
00:27:38,829 --> 00:27:40,150
geografické oblasti.
574
00:27:41,672 --> 00:27:43,996
A díky tomu jsme mohli spočítat takzvané
575
00:27:43,996 --> 00:27:46,079
Wrightovy F statistiky, Fst, Fis
576
00:27:46,079 --> 00:27:48,001
a Fit.
577
00:27:49,724 --> 00:27:52,207
A následně i určit
578
00:27:52,207 --> 00:27:54,170
takzvanou analýzu
579
00:27:54,170 --> 00:27:55,291
molekulární
580
00:27:56,903 --> 00:27:59,617
variance, která nám
581
00:27:59,617 --> 00:28:02,181
přisoudila, jaký je podíl
582
00:28:02,181 --> 00:28:05,064
variability mezi populacemi, mezi
583
00:28:05,064 --> 00:28:07,588
jedinci v populacích a uvnitř
584
00:28:07,588 --> 00:28:08,229
jedinců.
585
00:28:10,222 --> 00:28:12,384
Tabulka vlevo nám
586
00:28:12,384 --> 00:28:14,628
charakterizuje pro jednotlivé lokusy i
587
00:28:14,628 --> 00:28:16,550
celkový průměrnou hodnotu
588
00:28:17,311 --> 00:28:18,793
těchto F statistik.
589
00:28:20,365 --> 00:28:22,608
Přičemž Fst, je to asi ta
590
00:28:22,608 --> 00:28:24,811
nejzajímavější, protože ta nám říká , že její
591
00:28:24,811 --> 00:28:27,615
hodnota je o míře rozdílnosti
592
00:28:27,615 --> 00:28:30,139
mezi těmito subpopulacemi, to znamená
593
00:28:30,139 --> 00:28:33,023
mezi okresy. Hodnota je
594
00:28:33,023 --> 00:28:35,586
0,086, což není
595
00:28:35,586 --> 00:28:37,309
příliš vysoká hodnota,
596
00:28:38,230 --> 00:28:40,473
ale nějakým způsobem
597
00:28:40,473 --> 00:28:43,357
charakterizuje, že určitá diverzifikace
598
00:28:43,357 --> 00:28:46,321
tady je, sice ne moc velká, ale je.
599
00:28:48,294 --> 00:28:51,017
V tabulce vpravo pro změnu vidíme
600
00:28:51,017 --> 00:28:53,381
výsledek analýzy molekulární
601
00:28:53,381 --> 00:28:55,824
variance, kde v posledním sloupci
602
00:28:55,824 --> 00:28:57,586
vidíme, že
603
00:28:58,187 --> 00:29:00,751
variabilita mezi těmito
604
00:29:00,751 --> 00:29:03,554
regionálními populacemi, mezi okresy
605
00:29:03,995 --> 00:29:06,799
je pouze 1 % z celkové
606
00:29:07,320 --> 00:29:08,041
variability.
607
00:29:10,254 --> 00:29:13,158
Což právě není mnoho. Ale když jsme
608
00:29:13,158 --> 00:29:15,801
se dívali na ostatní publikace,
609
00:29:16,162 --> 00:29:18,765
tak přibližně 1-3 % bývá
610
00:29:19,166 --> 00:29:22,010
obvyklé číslo variability mezi
611
00:29:22,010 --> 00:29:24,213
nějakými geografickými oblastmi.
612
00:29:25,785 --> 00:29:28,428
Mezi jedinci uvnitř populací je
613
00:29:28,509 --> 00:29:31,393
variabilita vyjádřená 6 procenty
614
00:29:32,033 --> 00:29:34,957
a logicky největší podíl variability z
615
00:29:34,957 --> 00:29:36,600
celkové variability v populaci je
616
00:29:36,600 --> 00:29:38,362
variabilita uvnitř jedinců.
617
00:29:44,611 --> 00:29:46,653
Dále byly pomocí programu GenAlEx
618
00:29:46,653 --> 00:29:49,457
vypočítány párové Neiovy nestranné a
619
00:29:49,457 --> 00:29:51,820
párové Fst genetické distance.
620
00:29:53,172 --> 00:29:56,096
Tyto párové hodnoty, tyto distance
621
00:29:56,257 --> 00:29:59,020
byly využity pro výpočty
622
00:29:59,020 --> 00:30:01,664
nebo analýzu hlavních komponent PCA,
623
00:30:01,984 --> 00:30:04,268
jejíž grafické výstupy vidíme zde.
624
00:30:04,948 --> 00:30:07,672
Nahoře máme určeny
625
00:30:07,672 --> 00:30:10,516
vzdálenosti první a druhé
626
00:30:10,516 --> 00:30:13,080
komponenty mezi
627
00:30:13,080 --> 00:30:16,004
jednotlivými okresy. Pomocí
628
00:30:16,004 --> 00:30:18,807
Neiových nestranných distancí
629
00:30:19,168 --> 00:30:21,491
a ve spodní části máme
630
00:30:21,812 --> 00:30:24,575
výpočet porovnání první a
631
00:30:24,575 --> 00:30:27,299
druhé komponenty pomocí
632
00:30:27,299 --> 00:30:29,262
párových Fst distancí.
633
00:30:31,024 --> 00:30:32,506
Vidíme, že například
634
00:30:33,548 --> 00:30:35,270
okres Děčín DC
635
00:30:36,472 --> 00:30:39,115
nebo Frýdek Místek a podobné
636
00:30:39,115 --> 00:30:41,919
další okresy jsou trošku
637
00:30:41,919 --> 00:30:44,683
vzdálenější od toho shluku centrálního,
638
00:30:44,963 --> 00:30:47,527
mezi nimiž jsou sice nějaké vzdálenosti,
639
00:30:47,527 --> 00:30:50,250
ale nejsou tak výrazné. Takže
640
00:30:50,250 --> 00:30:52,814
existují oblasti, které se více
641
00:30:52,814 --> 00:30:55,578
odlišují od jiných oblastí.
642
00:30:59,082 --> 00:31:01,326
Stejná data jsme využili k analýze
643
00:31:01,326 --> 00:31:03,929
genetické diverzity a míry příměsí
644
00:31:04,250 --> 00:31:07,214
populaci včely medonosné bayezovskou
645
00:31:07,214 --> 00:31:09,817
metodou shlukování programem Structure.
646
00:31:11,399 --> 00:31:13,803
Bylo proveden v 10 nezávislých simulací,
647
00:31:14,043 --> 00:31:16,847
každá zahrnovala 10000 zahoření burning kroků
648
00:31:17,247 --> 00:31:19,410
a následně 100000 iterací Markovvovými
649
00:31:19,410 --> 00:31:20,892
řetězci Monte Carlo.
650
00:31:22,705 --> 00:31:25,308
Výsledky jsme dále analyzovali pomocí
651
00:31:25,308 --> 00:31:27,271
online programu Clumpak a Structure
652
00:31:27,271 --> 00:31:29,835
Selector, které mají
653
00:31:29,835 --> 00:31:31,877
implementované metody Evanovu a
654
00:31:31,877 --> 00:31:34,751
Puechmailovu. A tím jsme
655
00:31:34,751 --> 00:31:37,515
zjistili optimální počty shluků, těch
656
00:31:37,515 --> 00:31:40,038
klastrů, které nejlépe odpovídají
657
00:31:40,038 --> 00:31:40,800
datům.
658
00:31:42,161 --> 00:31:45,045
Delta k. MedMeaK,
659
00:31:45,045 --> 00:31:47,689
MaxMeaK, MedMedK
660
00:31:47,689 --> 00:31:48,290
a MaxMedK.
661
00:31:50,653 --> 00:31:53,577
V případě této populace
662
00:31:53,777 --> 00:31:56,141
oběma metodami
663
00:31:56,581 --> 00:31:59,465
bylo určeno, že v populaci včely
664
00:31:59,465 --> 00:32:01,548
medonosné v České republice na základě
665
00:32:01,548 --> 00:32:03,991
těchto 22 mikrosatelitních markerů
666
00:32:04,432 --> 00:32:06,755
se vyskytují tři geneticky
667
00:32:06,755 --> 00:32:09,519
odlišitelné populace a že
668
00:32:09,519 --> 00:32:12,162
lze s určitou vysokou mírou
669
00:32:12,483 --> 00:32:14,886
pravděpodobností každého jedince přiřadit
670
00:32:14,886 --> 00:32:17,169
do jedné z těchto tří skupin.
671
00:32:24,069 --> 00:32:25,831
Pro určení genetické struktury lze
672
00:32:25,831 --> 00:32:28,194
využívat i jiné metody, například
673
00:32:28,194 --> 00:32:30,598
diskriminační analýzu hlavních komponent
674
00:32:30,598 --> 00:32:32,841
DAPC, která je
675
00:32:32,841 --> 00:32:35,725
naprogramována v balíčku adgenet v rámci
676
00:32:35,725 --> 00:32:38,358
programu R. Touto
677
00:32:38,358 --> 00:32:41,242
metodou opět můžeme zjistit jakousi
678
00:32:41,242 --> 00:32:42,284
strukturu
679
00:32:43,245 --> 00:32:45,889
populace a
680
00:32:46,529 --> 00:32:49,133
hovořit o nějakých klastrech, nějakých
681
00:32:49,133 --> 00:32:51,696
skupinách, které se mezi sebou nějak liší
682
00:32:52,017 --> 00:32:53,980
a jedince je možné do těchto skupin
683
00:32:53,980 --> 00:32:56,904
jednoznačně přiřadit. V této
684
00:32:56,904 --> 00:32:58,826
populaci včely medonosné v České
685
00:32:58,826 --> 00:33:01,270
republice byly odhadnuty
686
00:33:01,910 --> 00:33:03,232
celkem pět
687
00:33:04,234 --> 00:33:06,917
skupin, pět klastrů,
688
00:33:06,997 --> 00:33:09,080
které se nějakým způsobem odlišovaly.
689
00:33:16,581 --> 00:33:17,982
A děkuji za vaši pozornost.