1
00:00:01,412 --> 00:00:04,017
Dobrý den, v této přednášce se budeme

2
00:00:04,017 --> 00:00:06,261
zabývat genomikou u hospodářských zvířat

3
00:00:06,581 --> 00:00:09,226
a především sekvenováním. Přednáška je

4
00:00:09,226 --> 00:00:11,550
součástí modulu 1 genetika zvířat.

5
00:00:12,111 --> 00:00:14,355
Vytvoření této prezentace bylo podpořeno

6
00:00:14,355 --> 00:00:16,999
garantem ERASMUS+ KA2 v rámci

7
00:00:17,039 --> 00:00:19,684
projektu ISAGREED, Inovace obsahu a

8
00:00:19,684 --> 00:00:22,208
struktury studijních programů v oblasti

9
00:00:22,208 --> 00:00:24,051
managementu živočišných, genetických a

10
00:00:24,051 --> 00:00:26,405
potravinových zdrojů s využitím

11
00:00:26,405 --> 00:00:27,006
digitalizace.

12
00:00:29,541 --> 00:00:31,985
Seklenování DNA je základní molekulárně

13
00:00:31,985 --> 00:00:34,750
genecká metoda. Metoda umožňuje přečíst

14
00:00:34,750 --> 00:00:37,194
genetickou informaci, která je uložena v

15
00:00:37,194 --> 00:00:39,678
formou sekvence neboli pořadí nukleotidů

16
00:00:39,678 --> 00:00:42,523
v molekule DNA. Na tomto obrázku

17
00:00:42,523 --> 00:00:44,246
uvádím přehled nejvýznamnějších

18
00:00:44,246 --> 00:00:46,530
sekvenčních metod od nejstarších

19
00:00:46,570 --> 00:00:49,215
po nejmodernějších. Chemická metoda

20
00:00:49,215 --> 00:00:51,899
založená na specifickém štěpení řetězce DNA

21
00:00:51,899 --> 00:00:54,063
a označovaná podle objevitelů jako

22
00:00:54,063 --> 00:00:56,858
Maxomova-Gilbertova byla 1 sekvenační

23
00:00:56,858 --> 00:00:59,012
metodou, nicméně dnes se už

24
00:00:59,052 --> 00:01:01,576
nepoužívá. Dodnes se využívá

25
00:01:01,576 --> 00:01:04,301
metoda objevená Frederickem Sangerem, po

26
00:01:04,301 --> 00:01:07,065
němž nese pojmenování. Označuje se též

27
00:01:07,065 --> 00:01:09,630
jako dideoxy metoda, protože využívá

28
00:01:09,630 --> 00:01:11,513
speciální modifikované nukleotidy

29
00:01:11,713 --> 00:01:14,398
takzvané koncové terminátory. Ty se

30
00:01:14,398 --> 00:01:16,041
přidávají do směsi k normálním

31
00:01:16,041 --> 00:01:18,365
nukleotidům a v případě jejich začlenění

32
00:01:18,365 --> 00:01:20,048
do řetězce se syntéza ukončuje.

33
00:01:20,929 --> 00:01:23,293
Pyrosekvenování a sekvenování pomocí

34
00:01:23,293 --> 00:01:25,497
hybridizace jsou alternativní metody,

35
00:01:26,349 --> 00:01:27,591
jejichž využití je v současnosti malé.

36
00:01:28,232 --> 00:01:30,315
Naopak seklenování nové generace (NGS)

37
00:01:31,107 --> 00:01:33,471
je velmi rozšířené a

38
00:01:33,471 --> 00:01:35,514
využívané z důvodu vysoké rychlosti

39
00:01:35,514 --> 00:01:38,279
a sekenační kapacity, neboť lze využít i na

40
00:01:38,279 --> 00:01:41,204
sekvenaci celých genomů a je označováno jako

41
00:01:41,204 --> 00:01:44,049
sekvenace 2. generace. Stále

42
00:01:44,049 --> 00:01:46,533
více se využívá metod založených na

43
00:01:46,533 --> 00:01:49,018
sekvenaci jednotlivé molekuly DNA

44
00:01:49,378 --> 00:01:51,943
označované jako sekvenování 3. generace.

45
00:01:52,824 --> 00:01:55,348
Velkou výhodou sekvenování je to, že

46
00:01:55,348 --> 00:01:57,071
umožňuje jednoduchou a přesnou

47
00:01:57,071 --> 00:01:58,955
identifikaci polymorfního místa,

48
00:01:59,726 --> 00:02:02,060
respektive mutace. Moderní

49
00:02:02,060 --> 00:02:04,905
automatické sekenátory jsou vhodné i pro

50
00:02:04,905 --> 00:02:06,187
přímou detekci polymorfizmů.

51
00:02:09,002 --> 00:02:10,605
Princip metody objevil v roce

52
00:02:10,605 --> 00:02:13,570
1977 anglický biochemik

53
00:02:13,570 --> 00:02:16,375
Frederick Sanger. Základem Sangerova

54
00:02:16,375 --> 00:02:18,819
sekvenování jsou dideoxynukleotidy

55
00:02:19,179 --> 00:02:22,024
označované ddNTP neboli

56
00:02:22,024 --> 00:02:24,749
koncové terminátory. Jedná se o

57
00:02:24,749 --> 00:02:27,153
modifikovaný nukleotid, který má

58
00:02:27,153 --> 00:02:30,078
odstraněnu vazebnou skupinu OH na

59
00:02:30,078 --> 00:02:32,883
3´ uhlíku deoxyribózy, která je

60
00:02:32,883 --> 00:02:35,367
nutná pro navázání dalšího nukleotidu.

61
00:02:36,229 --> 00:02:38,433
Po začlení ddNTP

62
00:02:39,184 --> 00:02:40,867
se tak syntéza řetězce zastaví,

63
00:02:41,388 --> 00:02:43,351
přičemž vznikne řetězec o velikosti a

64
00:02:43,351 --> 00:02:45,875
barvě odpovídající příslušnému

65
00:02:45,875 --> 00:02:47,238
nukleotidu na templátu.

66
00:02:50,573 --> 00:02:52,697
Proces sekvenace se skládá z několika

67
00:02:52,697 --> 00:02:55,261
kroků. Začíná přípravou vzorků,

68
00:02:55,582 --> 00:02:58,347
kterými je nejčastěji PCR produkt. Ten

69
00:02:58,347 --> 00:03:00,991
musí být přečištěn, aby obsahoval jen DNA

70
00:03:00,991 --> 00:03:03,556
templátu. Dále musíme znát

71
00:03:03,596 --> 00:03:05,279
alespoň přibližnou koncentraci.

72
00:03:06,160 --> 00:03:08,524
Vlastní sekvenační reakce je lineární

73
00:03:08,524 --> 00:03:11,369
cyklická enzymatická reakce, která musí

74
00:03:11,369 --> 00:03:14,054
obsahovat uvedené složky. Sekvenační

75
00:03:14,054 --> 00:03:16,378
primer nám vymezí začátek sekvenování,

76
00:03:17,179 --> 00:03:19,503
musí být použit vždy jen jeden, nikoliv 2 jako u PCR.

77
00:03:19,543 --> 00:03:22,458
Reakci katalizuje DNA

78
00:03:22,458 --> 00:03:24,341
polymeráza uvnitř reakčního kufru s

79
00:03:24,341 --> 00:03:27,307
přídavkem standardních dNTP (podobně

80
00:03:27,307 --> 00:03:30,151
jako u PCR) a navíc ddNTP.

81
00:03:30,151 --> 00:03:32,676
Následuje přečištění

82
00:03:32,676 --> 00:03:35,320
sekvenační reakce, kdy se musí odstranit

83
00:03:35,320 --> 00:03:37,404
volné značené ddNTP.

84
00:03:38,326 --> 00:03:40,209
Směs fragmentů je rozdělena pomocí

85
00:03:40,209 --> 00:03:42,974
kapilárníy elektroforézy v sekvenátoru a

86
00:03:42,974 --> 00:03:44,136
výsledek vyhodnocen.

87
00:03:46,309 --> 00:03:48,834
V současnosti se rutině využívá varianta

88
00:03:48,834 --> 00:03:51,358
označovaná jako čtyřbarevné terminátorové

89
00:03:51,358 --> 00:03:54,353
sekvenování. Jednotlivé terminační

90
00:03:54,353 --> 00:03:56,357
nukleotidy jsou značeny fluorescenčními

91
00:03:56,357 --> 00:03:58,881
barvami podle toho, jakou dusíkatou

92
00:03:58,881 --> 00:04:01,005
bázi nesou, resp. s jakým

93
00:04:01,005 --> 00:04:02,888
nukleotidem na templátu se párují.

94
00:04:03,649 --> 00:04:05,813
Působením polymerázy se syntetizují

95
00:04:05,813 --> 00:04:08,738
komplementární řetězce k tempátu, přičemž

96
00:04:08,738 --> 00:04:11,382
většinou jsou začleněni normální dNTP

97
00:04:11,663 --> 00:04:14,468
a řetězec se prodlouží, nahodile se, ale

98
00:04:14,468 --> 00:04:17,273
začleňují i ddNTP, které pak

99
00:04:17,273 --> 00:04:19,727
syntézu řetězce ukončí. Vzniklý

100
00:04:19,727 --> 00:04:22,251
fragment je označen fluorescenční barvou, která

101
00:04:22,251 --> 00:04:24,655
odpovídá nukleotidu na příslušné pozici

102
00:04:24,655 --> 00:04:25,136
templátu.

103
00:04:28,211 --> 00:04:30,936
Vzniká směs jednořetězcových, různě dlouhých

104
00:04:30,936 --> 00:04:33,500
a různě obarvených molekul. Abychom

105
00:04:33,500 --> 00:04:35,584
zjistili, na které pozici se vyskytuje

106
00:04:35,584 --> 00:04:37,948
která báze, musí proběhnout přesné

107
00:04:37,948 --> 00:04:40,312
elektroforetické rozdělení této směsi

108
00:04:40,312 --> 00:04:43,157
fragmentů. K tomu se využívá

109
00:04:43,157 --> 00:04:45,201
fluorescenční kapilární elektroforézy,

110
00:04:45,481 --> 00:04:47,004
která je základem genetických

111
00:04:47,004 --> 00:04:49,328
analyzátorů, neboli sekvenátorů.

112
00:04:50,009 --> 00:04:52,012
Tento přístroj dokáže fragmenty nejen

113
00:04:52,012 --> 00:04:54,617
rozdělit dle velikosti, ale přímo

114
00:04:54,617 --> 00:04:57,181
odečíst sekvenci nukleotidů na základě

115
00:04:57,181 --> 00:04:59,545
různobarevných píků. Například

116
00:04:59,545 --> 00:05:01,228
syntetizovaný řetězec dlouhý 100

117
00:05:01,228 --> 00:05:04,113
nukleotidů svítí zeleně, tj. v pozici

118
00:05:04,113 --> 00:05:06,838
100 templátu byl adenin, řetězec

119
00:05:06,838 --> 00:05:09,693
dlouhý 101 svítí červeně, tzn.

120
00:05:09,693 --> 00:05:11,896
v pozici 101 byl tymin a tak podobně.

121
00:05:14,451 --> 00:05:16,494
Sangerova metoda je nejrozšířenější

122
00:05:16,494 --> 00:05:18,858
sekvenační metodou. Mezi její

123
00:05:18,858 --> 00:05:21,623
výhody patří čtení relativně dlouhých

124
00:05:21,623 --> 00:05:24,228
řetězců DNA (cca

125
00:05:24,228 --> 00:05:26,872
 800 párů bází) a zároveň vysoká

126
00:05:26,872 --> 00:05:29,116
přesnost a spolehlivost. Pokud

127
00:05:29,116 --> 00:05:31,240
potřebujeme znát sekvenci nebo detekovat

128
00:05:31,240 --> 00:05:33,804
mutaci v konkrétním úseku genomu u jednoho nebo

129
00:05:33,804 --> 00:05:36,329
několika málo jedinců, tak se jedná o

130
00:05:36,329 --> 00:05:38,733
cenově nejvýhodnější variantu. Ve

131
00:05:38,733 --> 00:05:41,658
srovnání s metodami NGS je však výkon

132
00:05:41,658 --> 00:05:43,942
a cena za 1 osekvenovanou bázi velmi vysoká,

133
00:05:44,753 --> 00:05:46,236
metoda tedy není vhodná na sekvenování

134
00:05:46,236 --> 00:05:49,000
velkých úseků genomu, nebo dokonce celých

135
00:05:49,000 --> 00:05:49,281
genomů.

136
00:05:52,727 --> 00:05:55,131
Pro sekvenování celých genomů je vhodnější

137
00:05:55,131 --> 00:05:57,415
použít další metodu, a to takzvané

138
00:05:57,415 --> 00:06:00,139
sekvenování nové generace, ve zkratce

139
00:06:00,300 --> 00:06:03,145
NGS. Z tohoto důvodu se metoda

140
00:06:03,145 --> 00:06:05,709
označuje též jako celognomové seklenování

141
00:06:06,030 --> 00:06:08,113
nebo té jako sekvenování 2. generace.

142
00:06:08,875 --> 00:06:11,399
Metoda je založena na fragmentaci DNA

143
00:06:11,399 --> 00:06:13,883
a sekvenování krátkých fragmentů, ale v

144
00:06:13,883 --> 00:06:16,488
obrovském množství současně a označuje se

145
00:06:16,488 --> 00:06:19,052
tak jako masivní paralelní sekvenování.

146
00:06:19,853 --> 00:06:21,817
Metoda umožňuje obecně velmi vysokou

147
00:06:21,817 --> 00:06:24,381
kapacitu sekvenování, nicméně lze si

148
00:06:24,381 --> 00:06:26,896
vybrat varianty sekvenátorů s

149
00:06:26,896 --> 00:06:29,300
kapacitou podle vlastních potřeb

150
00:06:29,300 --> 00:06:32,145
od

151
00:06:32,145 --> 00:06:34,709
1 gigabáze po 8 terabází,

152
00:06:34,709 --> 00:06:36,993
což znamená 8 miliard bází.

153
00:06:39,617 --> 00:06:42,502
Mezi běžně rozšířené NGS sekvenátory patří

154
00:06:42,502 --> 00:06:45,467
přístroje firmy Illumina. Základem

155
00:06:45,467 --> 00:06:48,352
metody je takzvaná můstková PCR

156
00:06:48,352 --> 00:06:50,316
a sekvenace při syntéze s využitím

157
00:06:50,316 --> 00:06:53,000
čtyřbaroevné fluorescence. Vlastní

158
00:06:53,000 --> 00:06:55,004
sekvenace probíhá v klastrech stejné

159
00:06:55,004 --> 00:06:57,608
sekvence - barevně svítí příslušný

160
00:06:57,608 --> 00:07:00,493
spot podle báze. Sekvenují se

161
00:07:00,493 --> 00:07:02,978
úseky o velikosti od 150 do 300

162
00:07:02,978 --> 00:07:05,582
nukleotidů. Podrobnější vysvětlení je

163
00:07:05,582 --> 00:07:08,086
nad časový rámec této přednášky a

164
00:07:08,086 --> 00:07:10,410
zájemcům o pochopení této poměrně složité

165
00:07:10,410 --> 00:07:12,855
metody doporučuji shlédnutí videí na

166
00:07:12,975 --> 00:07:13,456
internetu.

167
00:07:16,140 --> 00:07:18,224
Sekvenování nové generace je dnes velmi

168
00:07:18,224 --> 00:07:20,107
využívaným nástrojem v genetice pro

169
00:07:20,107 --> 00:07:22,671
výzkum i diagnostiku. Vysoká

170
00:07:22,671 --> 00:07:24,875
kapacita metody umožňuje během několika

171
00:07:24,875 --> 00:07:27,720
hodin až dnů získat sekvenci i velkých

172
00:07:27,720 --> 00:07:30,244
genomů zvířat, například savců, jejichž

173
00:07:30,244 --> 00:07:32,248
velikost se pohybuje kolem tří miliard

174
00:07:32,248 --> 00:07:34,892
nukleotidů, což by metodou Sangerova

175
00:07:34,892 --> 00:07:37,858
sekvenování byla práce na několik let. Je

176
00:07:37,858 --> 00:07:39,661
možné takto získat celou genetickou

177
00:07:39,661 --> 00:07:41,995
informaci v jedince. Umožňuje proto

178
00:07:41,995 --> 00:07:43,597
nalézt velké množství nových nebo

179
00:07:43,597 --> 00:07:45,681
detekovat všechny známé polymorfismy a

180
00:07:45,681 --> 00:07:47,995
mutace. Vzniká, ale problém se

181
00:07:47,995 --> 00:07:50,559
zpracováním a vyhodnocením velkého množství dat,

182
00:07:50,840 --> 00:07:53,004
a proto je třeba využít velmi výkonných

183
00:07:53,004 --> 00:07:54,526
bioinformatických nástrojů.

184
00:07:55,247 --> 00:07:57,131
Celogenomová data jsou uložena v

185
00:07:57,131 --> 00:07:59,254
genomových databázích jednotlivých

186
00:07:59,254 --> 00:08:01,859
organismů, lze tak provádět srovnání s

187
00:08:01,859 --> 00:08:04,503
konkrétním vzorkem. Metoda má význam i

188
00:08:04,503 --> 00:08:06,627
pro sekvenování jednotlivce, např.

189
00:08:06,627 --> 00:08:08,831
pacienta, čemuž se věnuje obor

190
00:08:08,831 --> 00:08:09,953
personálních genomika.

191
00:08:12,277 --> 00:08:14,641
Jako sekvenování 3. generace jsou

192
00:08:14,641 --> 00:08:17,125
označovány sekvenační techniky založené na

193
00:08:17,125 --> 00:08:19,970
sekvenování jednotlivé molekuly. Výhodou

194
00:08:19,970 --> 00:08:22,294
jsou dlouhá čtení, v případě de novo

195
00:08:22,294 --> 00:08:25,139
seklenování až 7 kilobází. To

196
00:08:25,139 --> 00:08:27,303
umožňuje správně identifikovat varianty na

197
00:08:27,303 --> 00:08:30,067
jednom řetězci, tzv. haplotypy, což

198
00:08:30,067 --> 00:08:32,351
čtení krátkých sekvencí u 2. generace

199
00:08:32,351 --> 00:08:34,715
neumožňuje. Metoda je postupně

200
00:08:34,715 --> 00:08:36,839
zdokonalována, protože chybovost čtení

201
00:08:36,839 --> 00:08:38,963
je zatím ve srovnání s oběma předchozími

202
00:08:38,963 --> 00:08:41,647
generacemi vyšší. Dostupná je metoda

203
00:08:41,647 --> 00:08:44,091
označovaná jako Single molecul real time

204
00:08:44,091 --> 00:08:46,776
sequencing od firmy

205
00:08:46,776 --> 00:08:49,100
Pacific Bioscience nebo nanopórové

206
00:08:49,100 --> 00:08:51,504
sekvenátory firmy Oxford

207
00:08:51,504 --> 00:08:52,105
Nanopore.

208
00:08:55,090 --> 00:08:57,655
Výsledky celogenomového sekvenování

209
00:08:57,855 --> 00:09:00,339
jsou uloženy v genomových databázích a

210
00:09:00,339 --> 00:09:02,543
často volně dostupné. Například

211
00:09:02,543 --> 00:09:05,108
internetová databáze NCBI

212
00:09:05,148 --> 00:09:07,632
umožňuje prohlížení až na úroveň sekvence

213
00:09:07,632 --> 00:09:09,275
jednotlivých nukleotidů genu.

214
00:09:11,989 --> 00:09:14,113
Dalším praktickým využitím sekvenování

215
00:09:14,113 --> 00:09:16,197
živočichů je druhová identifikace.

216
00:09:16,798 --> 00:09:19,322
Molekulární taxonomie využívá takzvaný DNA

217
00:09:19,322 --> 00:09:22,007
barcoding, který umožňuje identifikovat

218
00:09:22,007 --> 00:09:24,211
druh, kde to nelze klasickou metodou

219
00:09:24,451 --> 00:09:27,095
například u larev hmyzu. Využívá se k

220
00:09:27,095 --> 00:09:29,099
tomuto účelu především fragmentů genu

221
00:09:29,099 --> 00:09:31,784
pro cytochrom C oxidázu 1, který leží v

222
00:09:31,784 --> 00:09:34,668
mitochondriální DNA. Tento fragment je

223
00:09:34,668 --> 00:09:37,353
osekvenován obvykle Sangerovou metodou a

224
00:09:37,353 --> 00:09:39,677
druhová identifikace provedena srovnáním s

225
00:09:39,677 --> 00:09:42,512
určenými sekvencemi uloženými v databázi

226
00:09:42,512 --> 00:09:44,796
BOLD nebo BLAST. Výhodou

227
00:09:44,796 --> 00:09:47,400
mitochondriální DNA je více kopií, to

228
00:09:47,400 --> 00:09:49,604
znamená větší množství DNA na množství

229
00:09:49,604 --> 00:09:52,289
biologického materiálu a vyšší stabilita.

230
00:09:52,770 --> 00:09:54,613
Využívá se tak i pro determinaci

231
00:09:54,613 --> 00:09:56,937
starších či muzejních vzorků.

232
00:09:57,498 --> 00:09:59,381
Nevýhodou je možnost kontaminace

233
00:09:59,381 --> 00:10:02,106
bakteriálním genomem, např. Wolbachia

234
00:10:02,306 --> 00:10:05,151
a podobně. Na

235
00:10:05,151 --> 00:10:07,355
tomto obrázku je ukázka konkrétní

236
00:10:07,355 --> 00:10:09,078
sekvence získané sekvenování

237
00:10:09,078 --> 00:10:11,522
mitochondriální DNA u starého

238
00:10:11,522 --> 00:10:12,564
muzejního vzorku.

239
00:10:17,352 --> 00:10:19,596
Vložením sekvence do internetového

240
00:10:19,596 --> 00:10:22,561
srovnávacího nástroje Blast se podařilo

241
00:10:22,561 --> 00:10:24,925
druh na základě homologie identifikovat.

242
00:10:32,598 --> 00:10:35,403
A nyní je přednáška u konce. Věříme,

243
00:10:35,563 --> 00:10:37,727
že jste pochopili základní principy jedné z

244
00:10:37,727 --> 00:10:39,690
nejdůležitějších molekulárně-genetických

245
00:10:39,690 --> 00:10:42,455
metod - sekvenování. Doporučuji i

246
00:10:42,455 --> 00:10:44,338
shlédnutí navazující prezentace

247
00:10:44,338 --> 00:10:47,223
laboratorní příklady. Děkuji za pozornost.