Dobrý den, v této přednášce se budeme
zabývat genomikou u hospodářských zvířat
a především sekvenováním. Přednáška je
součástí modulu 1 genetika zvířat.
Vytvoření této prezentace bylo podpořeno
garantem ERASMUS+ KA2 v rámci
projektu ISAGREED, Inovace obsahu a
struktury studijních programů v oblasti
managementu živočišných, genetických a
potravinových zdrojů s využitím
digitalizace.
Seklenování DNA je základní molekulárně
genecká metoda. Metoda umožňuje přečíst
genetickou informaci, která je uložena v
formou sekvence neboli pořadí nukleotidů
v molekule DNA. Na tomto obrázku
uvádím přehled nejvýznamnějších
sekvenčních metod od nejstarších
po nejmodernějších. Chemická metoda
založená na specifickém štěpení řetězce DNA
a označovaná podle objevitelů jako
Maxomova-Gilbertova byla 1 sekvenační
metodou, nicméně dnes se už
nepoužívá. Dodnes se využívá
metoda objevená Frederickem Sangerem, po
němž nese pojmenování. Označuje se též
jako dideoxy metoda, protože využívá
speciální modifikované nukleotidy
takzvané koncové terminátory. Ty se
přidávají do směsi k normálním
nukleotidům a v případě jejich začlenění
do řetězce se syntéza ukončuje.
Pyrosekvenování a sekvenování pomocí
hybridizace jsou alternativní metody,
jejichž využití je v současnosti malé.
Naopak seklenování nové generace (NGS)
je velmi rozšířené a
využívané z důvodu vysoké rychlosti
a sekenační kapacity, neboť lze využít i na
sekvenaci celých genomů a je označováno jako
sekvenace 2. generace. Stále
více se využívá metod založených na
sekvenaci jednotlivé molekuly DNA
označované jako sekvenování 3. generace.
Velkou výhodou sekvenování je to, že
umožňuje jednoduchou a přesnou
identifikaci polymorfního místa,
respektive mutace. Moderní
automatické sekenátory jsou vhodné i pro
přímou detekci polymorfizmů.
Princip metody objevil v roce
1977 anglický biochemik
Frederick Sanger. Základem Sangerova
sekvenování jsou dideoxynukleotidy
označované ddNTP neboli
koncové terminátory. Jedná se o
modifikovaný nukleotid, který má
odstraněnu vazebnou skupinu OH na
3´ uhlíku deoxyribózy, která je
nutná pro navázání dalšího nukleotidu.
Po začlení ddNTP
se tak syntéza řetězce zastaví,
přičemž vznikne řetězec o velikosti a
barvě odpovídající příslušnému
nukleotidu na templátu.
Proces sekvenace se skládá z několika
kroků. Začíná přípravou vzorků,
kterými je nejčastěji PCR produkt. Ten
musí být přečištěn, aby obsahoval jen DNA
templátu. Dále musíme znát
alespoň přibližnou koncentraci.
Vlastní sekvenační reakce je lineární
cyklická enzymatická reakce, která musí
obsahovat uvedené složky. Sekvenační
primer nám vymezí začátek sekvenování,
musí být použit vždy jen jeden, nikoliv 2 jako u PCR.
Reakci katalizuje DNA
polymeráza uvnitř reakčního kufru s
přídavkem standardních dNTP (podobně
jako u PCR) a navíc ddNTP.
Následuje přečištění
sekvenační reakce, kdy se musí odstranit
volné značené ddNTP.
Směs fragmentů je rozdělena pomocí
kapilárníy elektroforézy v sekvenátoru a
výsledek vyhodnocen.
V současnosti se rutině využívá varianta
označovaná jako čtyřbarevné terminátorové
sekvenování. Jednotlivé terminační
nukleotidy jsou značeny fluorescenčními
barvami podle toho, jakou dusíkatou
bázi nesou, resp. s jakým
nukleotidem na templátu se párují.
Působením polymerázy se syntetizují
komplementární řetězce k tempátu, přičemž
většinou jsou začleněni normální dNTP
a řetězec se prodlouží, nahodile se, ale
začleňují i ddNTP, které pak
syntézu řetězce ukončí. Vzniklý
fragment je označen fluorescenční barvou, která
odpovídá nukleotidu na příslušné pozici
templátu.
Vzniká směs jednořetězcových, různě dlouhých
a různě obarvených molekul. Abychom
zjistili, na které pozici se vyskytuje
která báze, musí proběhnout přesné
elektroforetické rozdělení této směsi
fragmentů. K tomu se využívá
fluorescenční kapilární elektroforézy,
která je základem genetických
analyzátorů, neboli sekvenátorů.
Tento přístroj dokáže fragmenty nejen
rozdělit dle velikosti, ale přímo
odečíst sekvenci nukleotidů na základě
různobarevných píků. Například
syntetizovaný řetězec dlouhý 100
nukleotidů svítí zeleně, tj. v pozici
100 templátu byl adenin, řetězec
dlouhý 101 svítí červeně, tzn.
v pozici 101 byl tymin a tak podobně.
Sangerova metoda je nejrozšířenější
sekvenační metodou. Mezi její
výhody patří čtení relativně dlouhých
řetězců DNA (cca
800 párů bází) a zároveň vysoká
přesnost a spolehlivost. Pokud
potřebujeme znát sekvenci nebo detekovat
mutaci v konkrétním úseku genomu u jednoho nebo
několika málo jedinců, tak se jedná o
cenově nejvýhodnější variantu. Ve
srovnání s metodami NGS je však výkon
a cena za 1 osekvenovanou bázi velmi vysoká,
metoda tedy není vhodná na sekvenování
velkých úseků genomu, nebo dokonce celých
genomů.
Pro sekvenování celých genomů je vhodnější
použít další metodu, a to takzvané
sekvenování nové generace, ve zkratce
NGS. Z tohoto důvodu se metoda
označuje též jako celognomové seklenování
nebo té jako sekvenování 2. generace.
Metoda je založena na fragmentaci DNA
a sekvenování krátkých fragmentů, ale v
obrovském množství současně a označuje se
tak jako masivní paralelní sekvenování.
Metoda umožňuje obecně velmi vysokou
kapacitu sekvenování, nicméně lze si
vybrat varianty sekvenátorů s
kapacitou podle vlastních potřeb
od
1 gigabáze po 8 terabází,
což znamená 8 miliard bází.
Mezi běžně rozšířené NGS sekvenátory patří
přístroje firmy Illumina. Základem
metody je takzvaná můstková PCR
a sekvenace při syntéze s využitím
čtyřbaroevné fluorescence. Vlastní
sekvenace probíhá v klastrech stejné
sekvence - barevně svítí příslušný
spot podle báze. Sekvenují se
úseky o velikosti od 150 do 300
nukleotidů. Podrobnější vysvětlení je
nad časový rámec této přednášky a
zájemcům o pochopení této poměrně složité
metody doporučuji shlédnutí videí na
internetu.
Sekvenování nové generace je dnes velmi
využívaným nástrojem v genetice pro
výzkum i diagnostiku. Vysoká
kapacita metody umožňuje během několika
hodin až dnů získat sekvenci i velkých
genomů zvířat, například savců, jejichž
velikost se pohybuje kolem tří miliard
nukleotidů, což by metodou Sangerova
sekvenování byla práce na několik let. Je
možné takto získat celou genetickou
informaci v jedince. Umožňuje proto
nalézt velké množství nových nebo
detekovat všechny známé polymorfismy a
mutace. Vzniká, ale problém se
zpracováním a vyhodnocením velkého množství dat,
a proto je třeba využít velmi výkonných
bioinformatických nástrojů.
Celogenomová data jsou uložena v
genomových databázích jednotlivých
organismů, lze tak provádět srovnání s
konkrétním vzorkem. Metoda má význam i
pro sekvenování jednotlivce, např.
pacienta, čemuž se věnuje obor
personálních genomika.
Jako sekvenování 3. generace jsou
označovány sekvenační techniky založené na
sekvenování jednotlivé molekuly. Výhodou
jsou dlouhá čtení, v případě de novo
seklenování až 7 kilobází. To
umožňuje správně identifikovat varianty na
jednom řetězci, tzv. haplotypy, což
čtení krátkých sekvencí u 2. generace
neumožňuje. Metoda je postupně
zdokonalována, protože chybovost čtení
je zatím ve srovnání s oběma předchozími
generacemi vyšší. Dostupná je metoda
označovaná jako Single molecul real time
sequencing od firmy
Pacific Bioscience nebo nanopórové
sekvenátory firmy Oxford
Nanopore.
Výsledky celogenomového sekvenování
jsou uloženy v genomových databázích a
často volně dostupné. Například
internetová databáze NCBI
umožňuje prohlížení až na úroveň sekvence
jednotlivých nukleotidů genu.
Dalším praktickým využitím sekvenování
živočichů je druhová identifikace.
Molekulární taxonomie využívá takzvaný DNA
barcoding, který umožňuje identifikovat
druh, kde to nelze klasickou metodou
například u larev hmyzu. Využívá se k
tomuto účelu především fragmentů genu
pro cytochrom C oxidázu 1, který leží v
mitochondriální DNA. Tento fragment je
osekvenován obvykle Sangerovou metodou a
druhová identifikace provedena srovnáním s
určenými sekvencemi uloženými v databázi
BOLD nebo BLAST. Výhodou
mitochondriální DNA je více kopií, to
znamená větší množství DNA na množství
biologického materiálu a vyšší stabilita.
Využívá se tak i pro determinaci
starších či muzejních vzorků.
Nevýhodou je možnost kontaminace
bakteriálním genomem, např. Wolbachia
a podobně. Na
tomto obrázku je ukázka konkrétní
sekvence získané sekvenování
mitochondriální DNA u starého
muzejního vzorku.
Vložením sekvence do internetového
srovnávacího nástroje Blast se podařilo
druh na základě homologie identifikovat.
A nyní je přednáška u konce. Věříme,
že jste pochopili základní principy jedné z
nejdůležitějších molekulárně-genetických
metod - sekvenování. Doporučuji i
shlédnutí navazující prezentace
laboratorní příklady. Děkuji za pozornost.