Dobrý den, v této prezentaci se budeme
zabývat základní metodou z oblasti
genomiky hospodářských zvířat, a to
sekvenováním. Na příkladu si ukážeme
laboratorní proces Sangerova
sekvenování na automatickém sekvenátoru.
Prezentace je součástí modulu 1 Genetika
zvířat. Vytvoření této prezentace bylo
podpořeno grantem Erasmus+ KA2
v rámci projektu ISAGREED
Inovace obsahu a struktury studijních
programů v oblasti managmentu živočišných,
genetických a potravinových zdrojů s
využitím digitalizace.
Vlastní laboratorní postup Sangerova
sekvenování zahrnuje několik kroků. Prvním
je příprava vhodného vzorku, to znamená DNA.
Jako vzorek může být použita DNA
klonovaná ve vektoru a získaná izolací z
bakteriálních buněk. Pro sekvenování se
zde používají univerzální primery, a
proto je výsledek obvykle vysoce
kvalitní. Ne vždy ale máme k dispozici
naklonovanou DNA, častěji jako templát
používáme PCR produkt. Zde je kritická
jeho čistota (PCR produkt musí být
přečištěn) a také jeho množství.
Pokud máme kvalitní vzorek, můžeme
přistoupit k druhému kroku - vlastní sekvenační
reakci. Jedná se enzymatickou reakci
podobnou PCR, nicméně musí se
použít pouze jeden primer a komerčně
dostupná reakční směs, která obsahuje
specificky fluorescenčně značené
dideoxynukleutyfosfáty
(každá báze jinou barvu), takzvané koncové
terminátory. Výsledkem je směs
fragmentů, z nichž každý je zakončen
terminátorem, který svou barvou indikuje
bazi v příslušném místě sekvence.
Detailní popis metody můžete vyslechnout
v přednášce k tomuto tématu.
Následuje odstranění volných nukleotidů a
přesná kapilární elektroforéza.
Posledním krokem je softwarové
vyhodnocení získaný dat a poskládání
konečné sekvence.
Jednou z možností odstranění volných nukleotidů,
především volných barevně značených
koncových terminátorů, je použití emulze
porézního činidla, které tyto nukleotidy
absorbuje a roztok se tak vyčistí. Před
přidáním do sekvenční směsi musí být činidlo
důkladně promícháno vortexováním a
následně odebráno špičkou s ustřiženým koncem.
Za tímto účelem je třeba nechat sekvenační
směs s emulzí třepat 30 minut.
Po centrifugaci se odebere supernatant do
sekvenačního plata a je připraven k
analýze v sekvenátoru.
Základem automatického sekenátoru je
fluorescenční kapilární elektroforéza. Na
tomto obrázku jsou vidět základní komponenty
přístroje - Vlevo je anodová část s pumpou
polymeru, uprostřed komůrka,
vpravo nahoře kapilární array a dole
plato se vzorky a katodová část.
Před každou separací pumpa natlačí
čerstvý polymer do kapilár, následně
je elektroinjektáží nabrán vzorek do kapiláry
a probíhá separace směrem od katody k
anodě. Fluorescenční signál je
snímám v detekční části.
Na tomto obrázku je detail s pumpou,
sáček s polymerem, anoda a
nádobka s anadovým pufrem.
Základem přesné separace DNA jsou
skleněné kapiláry naplněné polymerem.
Polymer je speciální gel se separační
schopností. DNA putuje kapilárou a
dělí se podle velikosti. Menší fragmenty
doputují k okénku dříve než delší a
přistroj odečte příslušný signál
(fluorescenční barvu).
Vložení čerstvého anodového
elektroforetického pufru musí proběhnout
velmi opatrně. Je vidět blok s čerpadlem,
které vždy před během přeplní kapiláru
čerstvým polymerem. Sáček vpravo
obsahuje separační polymer.
Automatický podavač se vysune a je
připraven na vložení plat se vzorky.
Vzorky s přečištěnou sekvenační reakcí
jsou umístěny na platu (to vididíte
uprostřed), které se uzavře do speciálního
držáku.
Nejprve vložíme kazetu s katodovým pufrem
(vlevo) a prolévacím roztokem (vpravo),
následně připravenou desku se
vzorky.
Po uzavření,
sekvenátor sám nejede do správné pozice.
Můžeme vložit maximálně dvě plata
vzorků, to znamená celkově 192
vzorků.
Po promývacím kroku jsou elektrody ponořeny do
vzorků
a probíhá elektroinjektáž do kapilár.
Následně jsou elektrody umístěny do
katodového pufru a začíná
elektroforéza.
Odečet fluorescenčního signálu probíhá
postupně tak, jak doputují příslušné
fragmenty k čidlu.
Po ukončení elektroforézy zkontrolujeme
surová data.
Vyhodnocení probíhá pomocí Sequencing
analysis software. Barva píku
odpovídá příslušné bázi v sekvenci, která
je uvedena nahoře. Zde vidíme i příklad
heterozygota, pozná se tak, že na stejné
pozici jsou píky dvou různých barev.
Lze využít specifického software pro
srovnání sekvencí velkého množství vzorků
a tím nalézt rozdíly - polymorfizmy.
U uvedených vzorků včel se vyskytují dva
typy polymorfizmů - deleční vlevo
a jednonukleotidový vpravo.
Vyhodnocení tohoto výsledku nám umožnilo
rozlišit různé haplotypy mitchondriální
DNA v naší populaci včel, které
souvisí s jejich původem.
Hotovou sekvenci můžeme exportovat ve
vhodném formátu pro další využití.
Pro srovnání hotových sekvencí je vhodný
například program Clustal. Můžeme tak
najít mutace způsobující onemocnění,
alely ovlivňující užitkové vlastnosti
hospodářských zvířat, stanovit genetickou
diverzitu v populaci zvířat, příbuznost
a mnoho dalších užitečných aplikací.
A to je vše k této krátké prezentaci
vysvětlující laboratorní postup určení
sekvence genetické informace. Věřím, že
názorné ukázky v tomto videu vám pomohou
pochopit jednu ze základních laboratorních
metod, bez kterých se moderní genetika
neobejde. Děkuji za pozornost.