1
00:00:01,083 --> 00:00:03,769
Dobrý den, v této prezentaci se budeme

2
00:00:03,769 --> 00:00:05,694
zabývat základní metodou z oblasti

3
00:00:05,694 --> 00:00:08,100
genomiky hospodářských zvířat, a to

4
00:00:08,100 --> 00:00:11,027
sekvenováním. Na příkladu si ukážeme

5
00:00:11,187 --> 00:00:12,912
laboratorní proces Sangerova

6
00:00:12,912 --> 00:00:15,277
sekvenování na automatickém sekvenátoru.

7
00:00:15,919 --> 00:00:18,565
Prezentace je součástí modulu 1 Genetika

8
00:00:18,565 --> 00:00:21,292
zvířat. Vytvoření této prezentace bylo

9
00:00:21,292 --> 00:00:23,898
podpořeno grantem Erasmus+ KA2

10
00:00:23,898 --> 00:00:26,304
v rámci projektu ISAGREED

11
00:00:26,625 --> 00:00:29,191
Inovace obsahu a struktury studijních

12
00:00:29,191 --> 00:00:31,547
programů v oblasti managmentu živočišných,

13
00:00:31,627 --> 00:00:34,474
genetických a potravinových zdrojů s

14
00:00:34,474 --> 00:00:35,918
využitím digitalizace.

15
00:00:40,088 --> 00:00:42,093
Vlastní laboratorní postup Sangerova

16
00:00:42,093 --> 00:00:45,060
sekvenování zahrnuje několik kroků. Prvním

17
00:00:45,060 --> 00:00:47,827
je příprava vhodného vzorku, to znamená DNA.

18
00:00:47,827 --> 00:00:50,474
Jako vzorek může být použita DNA

19
00:00:50,474 --> 00:00:53,200
klonovaná ve vektoru a získaná izolací z

20
00:00:53,200 --> 00:00:55,726
bakteriálních buněk. Pro sekvenování se

21
00:00:55,726 --> 00:00:58,132
zde používají univerzální primery, a

22
00:00:58,132 --> 00:00:59,856
proto je výsledek obvykle vysoce

23
00:00:59,856 --> 00:01:02,423
kvalitní. Ne vždy ale máme k dispozici

24
00:01:02,423 --> 00:01:05,390
naklonovanou DNA, častěji jako templát

25
00:01:05,390 --> 00:01:08,327
používáme PCR produkt. Zde je kritická

26
00:01:08,327 --> 00:01:10,803
jeho čistota (PCR produkt musí být

27
00:01:10,803 --> 00:01:13,049
přečištěn) a také jeho množství.

28
00:01:13,570 --> 00:01:15,655
Pokud máme kvalitní vzorek, můžeme

29
00:01:15,655 --> 00:01:18,622
přistoupit k druhému kroku - vlastní sekvenační

30
00:01:18,622 --> 00:01:21,349
reakci. Jedná se enzymatickou reakci

31
00:01:21,349 --> 00:01:23,795
podobnou PCR, nicméně musí se

32
00:01:23,795 --> 00:01:26,241
použít pouze jeden primer a komerčně

33
00:01:26,241 --> 00:01:28,888
dostupná reakční směs, která obsahuje

34
00:01:28,888 --> 00:01:30,892
specificky fluorescenčně značené

35
00:01:31,213 --> 00:01:33,178
dideoxynukleutyfosfáty

36
00:01:33,820 --> 00:01:36,677
(každá báze jinou barvu), takzvané koncové

37
00:01:36,677 --> 00:01:39,283
terminátory. Výsledkem je směs

38
00:01:39,283 --> 00:01:41,929
fragmentů, z nichž každý je zakončen

39
00:01:41,929 --> 00:01:44,847
terminátorem, který svou barvou indikuje

40
00:01:44,847 --> 00:01:46,771
bazi v příslušném místě sekvence.

41
00:01:47,533 --> 00:01:49,739
Detailní popis metody můžete vyslechnout

42
00:01:49,739 --> 00:01:51,222
v přednášce k tomuto tématu.

43
00:01:52,796 --> 00:01:54,761
Následuje odstranění volných nukleotidů a

44
00:01:54,761 --> 00:01:56,766
přesná kapilární elektroforéza.

45
00:01:57,407 --> 00:01:59,132
Posledním krokem je softwarové

46
00:01:59,132 --> 00:02:02,019
vyhodnocení získaný dat a poskládání

47
00:02:02,059 --> 00:02:03,382
konečné sekvence.

48
00:02:06,419 --> 00:02:09,066
Jednou z možností odstranění volných nukleotidů,

49
00:02:09,387 --> 00:02:11,151
především volných barevně značených

50
00:02:11,151 --> 00:02:13,838
koncových terminátorů, je použití emulze

51
00:02:13,838 --> 00:02:16,444
porézního činidla, které tyto nukleotidy

52
00:02:16,444 --> 00:02:19,371
absorbuje a roztok se tak vyčistí. Před

53
00:02:19,371 --> 00:02:21,617
přidáním do sekvenční směsi musí být činidlo

54
00:02:21,617 --> 00:02:24,464
důkladně promícháno vortexováním a

55
00:02:24,464 --> 00:02:27,070
následně odebráno špičkou s ustřiženým koncem.

56
00:02:32,954 --> 00:02:35,080
Za tímto účelem je třeba nechat sekvenační

57
00:02:35,080 --> 00:02:37,526
směs s emulzí třepat 30 minut.

58
00:02:44,843 --> 00:02:47,169
Po centrifugaci se odebere supernatant do

59
00:02:47,169 --> 00:02:49,535
sekvenačního plata a je připraven k

60
00:02:49,535 --> 00:02:50,898
analýze v sekvenátoru.

61
00:02:52,913 --> 00:02:55,800
Základem automatického sekenátoru je

62
00:02:55,800 --> 00:02:58,687
fluorescenční kapilární elektroforéza. Na

63
00:02:58,687 --> 00:03:01,093
tomto obrázku jsou vidět základní komponenty

64
00:03:01,093 --> 00:03:03,900
přístroje - Vlevo je anodová část s pumpou

65
00:03:03,900 --> 00:03:06,667
polymeru, uprostřed komůrka,

66
00:03:07,148 --> 00:03:09,754
vpravo nahoře kapilární array a dole

67
00:03:09,754 --> 00:03:11,960
plato se vzorky a katodová část.

68
00:03:12,682 --> 00:03:14,767
Před každou separací pumpa natlačí

69
00:03:14,767 --> 00:03:17,694
čerstvý polymer do kapilár, následně

70
00:03:17,694 --> 00:03:20,019
je elektroinjektáží nabrán vzorek do kapiláry

71
00:03:20,811 --> 00:03:22,856
a probíhá separace směrem od katody k

72
00:03:22,856 --> 00:03:25,693
anodě. Fluorescenční signál je

73
00:03:25,693 --> 00:03:27,097
snímám v detekční části.

74
00:03:29,823 --> 00:03:32,269
Na tomto obrázku je detail s pumpou,

75
00:03:32,711 --> 00:03:35,317
sáček s polymerem, anoda a

76
00:03:35,317 --> 00:03:37,001
nádobka s anadovým pufrem.

77
00:03:41,652 --> 00:03:43,898
Základem přesné separace DNA jsou

78
00:03:43,898 --> 00:03:46,063
skleněné kapiláry naplněné polymerem.

79
00:03:46,785 --> 00:03:49,071
Polymer je speciální gel se separační

80
00:03:49,071 --> 00:03:51,958
schopností. DNA putuje kapilárou a

81
00:03:51,958 --> 00:03:54,484
dělí se podle velikosti. Menší fragmenty

82
00:03:54,484 --> 00:03:56,970
doputují k okénku dříve než delší a

83
00:03:56,970 --> 00:03:59,055
přistroj odečte příslušný signál

84
00:03:59,296 --> 00:04:00,218
(fluorescenční barvu).

85
00:04:02,965 --> 00:04:04,649
Vložení čerstvého anodového

86
00:04:04,649 --> 00:04:06,854
elektroforetického pufru musí proběhnout

87
00:04:06,854 --> 00:04:09,781
velmi opatrně. Je vidět blok s čerpadlem,

88
00:04:10,142 --> 00:04:12,027
které vždy před během přeplní kapiláru

89
00:04:12,027 --> 00:04:14,633
čerstvým polymerem. Sáček vpravo

90
00:04:14,633 --> 00:04:16,157
obsahuje separační polymer.

91
00:04:28,597 --> 00:04:31,043
Automatický podavač se vysune a je

92
00:04:31,043 --> 00:04:33,930
připraven na vložení plat se vzorky.

93
00:04:47,644 --> 00:04:49,970
Vzorky s přečištěnou sekvenační reakcí

94
00:04:49,970 --> 00:04:52,416
jsou umístěny na platu (to vididíte

95
00:04:52,416 --> 00:04:55,062
uprostřed), které se uzavře do speciálního

96
00:04:55,062 --> 00:04:55,583
držáku.

97
00:05:14,379 --> 00:05:16,865
Nejprve vložíme kazetu s katodovým pufrem

98
00:05:16,865 --> 00:05:19,031
(vlevo) a prolévacím roztokem (vpravo),

99
00:05:20,414 --> 00:05:23,061
následně připravenou desku se

100
00:05:23,061 --> 00:05:23,622
vzorky.

101
00:05:30,719 --> 00:05:31,802
Po uzavření,

102
00:05:33,205 --> 00:05:35,812
sekvenátor sám nejede do správné pozice.

103
00:05:51,590 --> 00:05:53,635
Můžeme vložit maximálně dvě plata

104
00:05:53,635 --> 00:05:56,563
vzorků, to znamená celkově 192

105
00:05:56,563 --> 00:05:57,084
vzorků.

106
00:06:10,727 --> 00:06:13,614
Po promývacím kroku jsou elektrody ponořeny do

107
00:06:13,614 --> 00:06:14,296
vzorků

108
00:06:19,218 --> 00:06:21,905
a probíhá elektroinjektáž do kapilár.

109
00:06:45,442 --> 00:06:47,487
Následně jsou elektrody umístěny do

110
00:06:47,487 --> 00:06:49,612
katodového pufru a začíná

111
00:06:49,612 --> 00:06:50,615
elektroforéza.

112
00:06:54,895 --> 00:06:57,021
Odečet fluorescenčního signálu probíhá

113
00:06:57,021 --> 00:06:59,787
postupně tak, jak doputují příslušné

114
00:06:59,787 --> 00:07:00,870
fragmenty k čidlu.

115
00:07:03,196 --> 00:07:05,441
Po ukončení elektroforézy zkontrolujeme

116
00:07:05,441 --> 00:07:06,444
surová data.

117
00:07:09,130 --> 00:07:11,777
Vyhodnocení probíhá pomocí Sequencing

118
00:07:11,817 --> 00:07:14,463
analysis software. Barva píku

119
00:07:14,463 --> 00:07:17,230
odpovídá příslušné bázi v sekvenci, která

120
00:07:17,230 --> 00:07:20,037
je uvedena nahoře. Zde vidíme i příklad

121
00:07:20,037 --> 00:07:22,764
heterozygota, pozná se tak, že na stejné

122
00:07:22,764 --> 00:07:25,009
pozici jsou píky dvou různých barev.

123
00:07:28,618 --> 00:07:30,903
Lze využít specifického software pro

124
00:07:30,903 --> 00:07:33,550
srovnání sekvencí velkého množství vzorků

125
00:07:33,991 --> 00:07:36,036
a tím nalézt rozdíly - polymorfizmy.

126
00:07:36,718 --> 00:07:38,963
U uvedených vzorků včel se vyskytují dva

127
00:07:38,963 --> 00:07:41,650
typy polymorfizmů - deleční vlevo

128
00:07:42,131 --> 00:07:43,895
a jednonukleotidový vpravo.

129
00:07:44,657 --> 00:07:47,023
Vyhodnocení tohoto výsledku nám umožnilo

130
00:07:47,023 --> 00:07:49,429
rozlišit různé haplotypy mitchondriální

131
00:07:49,429 --> 00:07:51,995
DNA v naší populaci včel, které

132
00:07:51,995 --> 00:07:53,439
souvisí s jejich původem.

133
00:07:55,995 --> 00:07:58,401
Hotovou sekvenci můžeme exportovat ve

134
00:07:58,401 --> 00:08:00,646
vhodném formátu pro další využití.

135
00:08:03,072 --> 00:08:05,518
Pro srovnání hotových sekvencí je vhodný

136
00:08:05,518 --> 00:08:08,405
například program Clustal. Můžeme tak

137
00:08:08,405 --> 00:08:11,252
najít mutace způsobující onemocnění, 

138
00:08:11,252 --> 00:08:13,177
alely ovlivňující užitkové vlastnosti

139
00:08:13,177 --> 00:08:15,783
hospodářských zvířat, stanovit genetickou

140
00:08:15,783 --> 00:08:18,590
diverzitu v populaci zvířat, příbuznost

141
00:08:18,791 --> 00:08:20,876
a mnoho dalších užitečných aplikací.

142
00:08:24,384 --> 00:08:26,550
A to je vše k této krátké prezentaci

143
00:08:26,550 --> 00:08:28,915
vysvětlující laboratorní postup určení

144
00:08:28,915 --> 00:08:31,762
sekvence genetické informace. Věřím, že

145
00:08:31,762 --> 00:08:34,088
názorné ukázky v tomto videu vám pomohou

146
00:08:34,088 --> 00:08:36,093
pochopit jednu ze základních laboratorních

147
00:08:36,093 --> 00:08:38,659
metod, bez kterých se moderní genetika

148
00:08:38,659 --> 00:08:41,226
neobejde. Děkuji za pozornost.