Dobrý deň, moje meno je Nina Moravčíková a dnes by som vám rada predstavila prednášku s názvom
"Analýza stavu biodiverzity živočíšnych genetických zdrojov pomocou genomických údajov", ktorá je súčasťou modulu 2: "Konzervovanie a udržateľné využívanie
živočíšnych genetických zdrojov" v rámci projektu ISAGREED. Aj keď je táto prednáška určená pre študentov na II. stupni vzdelávania,
môže byť prospešná aj v rámci výučby pre študentov na I. aj III. stupni štúdia.
V súvislosti s hodnotením genomických údajov je potrebné v prvom rade v skratke popísať ako takéto informácie môžeme získať. Na analýzu genómu môžeme využiť
rôzne nástroje vrátane jednotlivých genetických markerov, genotypyzačných čipov či celogenómového sekvenovania. Rozdiel medzi uvedenými metódami súvisí jednak so
samotným laboratórnym postupom ich stanovenia a súčasne s množstvom údajov o genóme, ktoré prostredníctvom nich získame.
Čo môžme chápať pod pojmom genetický marker? Jedná sa o akýkoľvek charakteristický znak alebo prejav organizmu, ktorý môže byť využitý na určenie
špecifického chromozómu bunky alebo jedinca. Pojmom genetický marker môže byť označený krátky úsek, prípadne iné prejavy genotypu, chromozómov alebo karyotypu.
Dôležité však je si zapamätať, že genetický marker je zvyčajne
polymorfný variant, ktorý vykazuje mendelistickú dedičnosť a je vo vzťahu s variabilitou fenotypového znaku, čiže vlastnosti, ktorá má význam napríklad z pohľadu šľachtenia.
Z pohľadu produkčných vlastností hospodárskych zvierat sa sledujú jednak kandidátske gény, pretože ich alely a genotypy ovplyvňujú utváranie
kvantitatívnych znakov a súčasne aj lokusy pre kvantitatívne vlastnosti.
Výhodou DNA markerov je najmä fakt, že sú priamo detekovateľné v sekvenciách nukleotidov, vykazujú zvýšenú mieru polymorfizmu a dominantnú, respektíve
kodominantnú dedičnosť. DNA markery sa vyskytujú v genóme pomerne často, pričom ich v súčasnosti vieme relatívne ľahko a rýchlo testovať s vysokou mierou reprodukovateľnosti.
Medzi v súčasnosti najčastejšie využívané genetické markery patria jednoznačne jednonukleotidové polymorfizmy označované skratkou SNP.
SNP vznikajú zvyčajne bodovou mutáciou, napríklad zámenou nukleotidu v určitom mieste. Oproti iným typom genetických markerov sa v genóme vyskytujú často a to
každých 100 až 300 bázových párov. Za SNP sa zvyčajne považujú mutácie, ktoré sa v danej populácii vyskytujú s frekvenciou vyššou ako 1%, t.j. minoritná
alebo menej častá alela je prítomná v genotype minimálne 1 percenta jedincov patriacich do danej populácie.
Jedná sa o bialelický marker, t.j. v rámci populácie rozpoznávame pre SNP iba dve alely a to dominantnú a recesívnu. Pojem dominantná vyjadruje, že sa jedná o
prevládajúcu alelu u jedincov v danej populácii. Minoritná je naopak alela, ktorá sa v rámci populácie vyskytuje v genotypoch jedincov menej často.
Avšak treba si uvedomiť, že aj keď je v jednej populácii alela dominantná v inej z rozdielnym genetickým pôvodom to tak byť nemusí.
SNP markery majú naozaj široké využitie a to od hodnotenia biodiverzity až po genomickú selekciu.
Celogenómové sekvenovanie je pojem, ktorý sa využíva na označenie procesu stanovenia presného poradia nukleotidov v reťazci molekuly DNA, teda určenia jej
primárne štruktúry. Za klasické metódy možno považovať Maxam-Gilbertovu a Sangerovu,od ktorej sa odvíjajú v súčasnosti využívané metódy sekvenovania novej generácie.
V rámci NGS metód
existuje viacero platforiem, ktoré sa síce líšia v technologickom prístupe, ale prinášajú porovnateľné výstupy.
Aj keď sa cena celogenómového sekvenovania významne znížila v porovnaní s predchádzajúcim obdobím, v prípade ak chceme získať celopopulačné dáta je stále
vysoká, hlavne aj sa jedná o sekvenovanie s vysokým pokrytím. V súčasnosti sú v rámci celopopulačných štúdií aj z tohto dôvodu využívané SNP genotypizačné čipy,
ktoré umožňujú v rámci nižších nákladov získať informáciu o veľkom počte SNP markerov distribuovaných rovnomerne v genóme.
SNP čipy umožňujú genotypovanie od niekoľko tisíc až po 700 000 SNP markerov. Sú dostupné pre väčšinu druhov nielen hospodárskych ale aj spoločenských druhov
zvierat. Takto získané informácie možno použiť na rôznorodé účely, vrátane testovania rodičovstva, stavu genomickej diverzity, celogenómové asociačné štúdie či odhad genomických plemenných hodnôt.
V rámci nasledujúcich snímok budeme hovoriť o ukazovateľoch, ktoré sa používajú na odhad stavu biodiverzity živočíšnych genetických zdrojov na podklade analýzy
genomických dát. Jedným z ukazovateľov je homozygotnosť genómu a genomický inbríding. V súvislosti s homozygotnosťou genómu sa v literatúre často stretnete s
dvoma pojmami a toautozygotnosť a homozygotné úseky, označované skratou ROH. Autozygotnosť v podstate reflektuje všetky alely alebo chromozomálne úseky
DNA, ktoré sú identické podľa pôvodu, t.j. pochádzajú od spoločného predka. Za homozygotné úseky sa považujú všetky genomické oblasti so špecifickým počtom za
sebou nasledujúcich homozygotných genotypov, respektíve ak hovoríme o testovaní SNP markerov všetkých homozygotných SNP markerov. Distribúcia, počet a dĺžka
homozygotných úsekov závisí od rôznych faktorov, ktoré ovplyvňujú genóm hospodárskych zvierat.
Za najvýznamnejšie z tohto pohľadu možno považovať zámernú selekciu a intenzitu príbuzenskej plemenitby. Samotná dĺžka ROH úsekov v genóme jedinca korešponduje
so vzdialenosťou predkov v rodokmeni jedinca. V prípade, ak majú rodičia jedinca spoločného predka ich genóm bude v určitých oblastiach zdieľať rovnaké genetické
varianty, čiže takíto rodičia budú identicky podľa pôvodu. Ak obidvaja rodičia prenesú na potomka rovnaký úsek,
potom bude tento homozygotný pre dané genetické varianty, čím vznikne ROH úsek v genóme jedinca.
Práve tento predpoklad je základom prístupu pre odhad genomického koeficienta inbrídingu cez pokrytie genómu homozygotnými úsekmi.
Informáciu o výskyte a dĺžke ROH úsekov v genóme však možno využiť nielen na odhad genomického inbrídingu, ale aj na testovanie vplyvu zámernej selekcie na
špecifické oblasti v genóme či identifikáciu kauzálnych variánt podieľajúcich sa na kontrole preferovaných znakov a vlastností.
Na tejto snímke môžete vidieť v prvej časti vzorec pre odhad genomického inbrídingu označovaného ako Froh, pričom čitateľ vyjadruje celkovú dĺžku homozygotných úsekov
v genóme jedinca a menovateľ celkovú dĺžku genómu odvodenú od fyzickej pozície testovaných markerov.
Froh umožňuje stanoviť trend vývoja inbrídingu, pričom úseky dlhšie ako 4 Mb reflektujú autozygotné
segmenty pochádzajúce od predkov vzdialených približne 12 generácií,
úseky dlhšie ako 8 Mb pochádzajú od predkov vzdialených 6 generácií a úseky dlhšie ako 16 Mb zodpovedajú podielu autozygotnosti zdedeného od predkov z posledných
3 generácií. Podobne ako pri rodokmeňovom inbrídingu sa rozpätie hodnôt genomického inbrídingu pohybuje od 0 po 1, respektíve v percentuálnom vyjadrení od 0
po 100%. Informácia o prírastku inbrídingu za generáciu a celkovo koeficiente príbuzenskej plemenitby je dôležitá
jednak z pohľadu výskytu inbrednej depresie a súčasne prežiteľnosti populácie z dlhodobého hľadiska. Jedným z dôvodov je fakt, že kumulácia inbrídingu naprieč
generáciami vedie k zníženiu genetickej diverzity. Vo všeobecnosti sa uvádza, že prírastok inbrídingu za generáciu by v prípade málopočetných populácií nemal presiahnuť 1% a vo veľkých populáciách 4%.
Medzi najčastejšie využívané programy na stanovenie genomického koeficienta inbrídingu patrí
detectRUNS či cgaTOH. Na obrázku môžeme vidieť výsledky komparatívne analýzy koeficienta inbrídingu u 15 plemien dobytka na základe úsekov dlhších ako 4 a 8 Mb.
Ďalším ukazovateľom biodiverzity, ktorý vieme stanoviť na základe testovania genomických dát, je väzbová nerovnováha medzi SNP markermi v genóme a následne
na jej podklade efektívna veľkosť populácie. Pojem väzbová nerovnováha vyjadruje v podstate nenáhodný vzťah alebo asociáciu medzi alelami rôznych SNP markerov v
genóme hodnotenej populácie, ktorá vznikla pravdepodobne v dôsledku selekcie, systémov priparovania či rekombinácie alebo genetického driftu.
Vo výsledku to znamená, že takéto genetické varianty môžu v populácii vytvárať špecifické kombinácie genotypov, ktoré sa nazývajú aj haplotypy. Informáciu o úrovni
väzbovej nerovnováhy môžeme využiť na zhodnotenie evolučného utvárania populácií, odhad efektívnej veľkosti, či podobne ako v prípade ROH úsekov na testovanie výskytu
špecifických genetických variant, ktoré podliehali intenzívnemu vplyvu zámernej alebo prírodnej selekcie.
Na snímke je uvedený najčastejšie využívaný vzorec na výpočet väzbovej nerovnováhy medzi SNP markermi. Okrem tohto vzorca navrhnutého Hillom a Robertsonom však
existujú aj iné jeho modifikácie, ktoré zohľadňujú napríklad rýchlosť mutácií či povahu testovaných genetických markerov, ktoré môžu byť bialelické alebo mmultialelické.
Rozpätie hodnôt sa v prípade väzbovej nerovnováhy pohybuje od 0 po 1, kedy 0 vyjadruje väzbovú rovnováhu medzi markermi a 1
naopak kompletnú väzbovú nerovnováhou.
Efektívna veľkosť populácie v podstate vyjadruje počet jedincov, ktorí sú v danej populácii reprodukčne aktívny, t.j. môžu poskytovať jedincov do ďalšej generácie.
Odhad tohto parametra je v prípade genomických dát najčastejšie založený na jeho vzťahu k miere väzbovej nerovnováhy v genóme,
pričom je možné testovať nielen súčasnú efektívnu veľkosť, ale aj trend jej vývoja v minulosti.
Efektívnu veľkosť populácie označovanú skratkou Ne možno stanoviť napríklad na základe vzorca navrhnutého Corbinom et al., ktorý vidíte na tejto snímke.
Tento vzorec zohľadňuje model dedivosti, fyzickú vzdialenosť medzi SNP markermi či intenzitu mutácií. Historická efektívna veľkosť je v tomto prípade odhadovaná ako
funkcia času a fyzickej vzdialenosti medzi dvoma markermi za predpokladu konštantného lineárneho rastu
Ne s časom vyjadreným minulými generáciami. Na obrázku vpravo vidíte reprezentatívne výsledky analýzy trendu vývoja efektívnej veľkosti u 2 plemien
hovädzieho dobytka: slovenského strakatého a slovenského pinzgauského. Podobne ako pri rodokmeňových informáciách môže efektívna veľkosť populácie nadobúdať
hodnoty od 0 po n. Všeobecne je akceptované, že efektívna veľkosť populácie by nemala byť nižšia ako 50 jedincov v prípade málo početných populácií,
respektíve 100 jedincov v prípade veľkých populácií. Z pohľadu dlhodobej udržateľnosti by mala byť efektívna veľkosť populácie minimálne 500 jedincov.
V prípade genomických dát môžeme na výpočet použiť programy ako SneP alebo GONE.
U živočíšnych genetických zdrojov sú často vyhodnocované aj ukazovatele popisujúce populačnú štruktúru, t.j. ich rôznorodosť na vnútro aj medzipopulačnej úrovni.
Z tohto pohľadu sú najčastejšie vyhodnocované genetické vzdialenosti, ktoré vyjadrujú stupeň génovej rozdielnosti medzi jedincami, populáciami alebo druhmi.
Najčastejšie sa v literatúre stretávame s Neiovými genetickými vzdialenosťami, Wrightovým fixačným indexom Fst, analýzou
hlavných komponentov či metódami kvantifikujúcimi stupeň genetického premiešania a toku génov medzi populáciami.
Teória Neiovej genetickej vzdialenosti predpokladá, že ak sú 2 populácie vykazujúce nízke genetické vzdialenosti podobné, tak s vysokou mierou spoľahlivosti majú
spoločných predkov. Z tohto dôvodu možno tento ukazovateľ považovať aj za molekulárny ekvivalent koeficienta príbuznosti počítaného na základe rodokmeňových
informácií. Vzorec pre výpočet štandardnej Neiovej genetickej vzdialenosti máte uvedený na snímke. Minimálna hodnota,
ktorú môžeme Neiova genetická vzdialenosť nadobúdať je 0. Táto hodnota znamená, že jedince alebo populácie majú v genóme rovnaké varianty (alely alebo genotypy), t.j. sú geneticky identické.
Maximálna hodnota, ktorú môže nadobúdať Neiova genetická vzdialenosť je 1. Táto hodnota vyjadruje fakt, že v dôsledku úplne rozdielnych genetických variantov sú
jedince alebo populácie geneticky rozdielne, môžeme povedať aj nepríbuzné. Na výpočet Neiových
genetických vzdialeností môžeme využiť balíky programu R StAMPP, Poppr alebo iné programy.
V porovnaní s Neiovou genetickou vzdialenosťou umožňuje Wrightov fixačný index Fst stanoviť mieru rôznorodosti iba na populačnej úrovni. Tento index je v podstate
indikátorom intenzity fragmentácie populácie vyjadrenej poklesom heterozygotnosti v subpopuláciách v dôsledku pôsobenia genetického driftu. Z tohto vyplýva, že ak
chceme tento index stanoviť, musíme mať k dispozícii informácie o očakávanej heterozygotnosti v rámci metapopulácie
a priemernej heterozygotnosti v rámci subpopulácií ako môžeme vidieť vo vzorci na snímke. Wrightov fixačný index nadobúda hodnoty od 0 po 1,
pričom interpretácia hodnôt je podobná ako v prípade Neiových genetických vzdialeností.
To znamená, že ak je hodnota indexu rovná 0 populácie sú geneticky identické a naopak, ak je hodnota rovná 1 populácii sú geneticky rozdielne.
V reálnych populáciách hospodárskych zvierat sa hodnota tohto indexu pohybuje zvyčajne od 0 po 0,5,
samozrejme ak testujeme jeden druh. Za geneticky dostatočne diferencované alebo inak povedané odlíšiteľné považujeme populácie s hodnotou Fst indexu vyššou ako 0,25.
Medzi ďalšie, často používané prístupy na vyhodnotenie populačnej štruktúry a genetických vzťahov medzi populáciami patria analýza hlavných komponentov a
Bayesianská analýza genetického premiešania alebo inak povedané admixie. Analýza hlavných komponentov je populárna viacrozmerná štatistická metóda, ktorá našla
využitie v rôznych vedných odvetviach vrátane populačnej genetiky. Zjednodušene možno povedať, že táto analýza slúži na znázornenie nadrozmerných dát,
napríklad genomických informácií o jedincoch alebo populáciách, v menšom počte dimenzií. Bayesianská štatistika je rovnako metódou, ktorá sa využíva aj v iných
vedných odboroch. Táto štatistika pracuje s podmienenou pravdepodobnosťou a umožňuje spresniť pravdepodobnosť východiskovej hypotézy v slede ako sa objavujú ďalšie relevantné skutočnosti.
Na tejto snímke sú znázornené reprezentatívne výsledky testovania podielu genetického premiešania, analýzy hlavných komponentov a toku génov.
V prípade prvého obrázku sa jedná o Bayesianskú analýzu admixie v rámci 15 plemien hovädzieho dobytka, pričom podiel premiešania v rámci plemien je znázornený
rozdielnymi farbami čiar. Na druhom obrázku vľavo sú zasa uvedené reprezentatívne výsledky analýzy hlavných komponentov, pričom miera premiešania
je najlepšie vidieť v časti D prostredníctvom prekrývajúcich sa píkov rozdielnych farieb. Na 3 obrázku vpravo vidíme opätovne výsledky analýzy
genetického premiešania 4 plemien a nižšie číselné vyjadrenie toku génov medzi genofondami populácií.
Ako som už spomínala pri ROH úsekoch a väzbovej nerovnováhe okrem štandardných ukazovateľov ako Ne a F, vieme hodnotiť aj vplyv selekcie na štruktúru, respektíve
konkrétne genetické varianty v špecifických oblastiach v genóme populácií. Tento prístup na rozdiel od celogenómových asociačných štúdií nevyžaduje prístup k
fenotypových informáciám o jedincoch. Jedná sa v podstate o identifikáciu takzvaných selekčných signálov,
ktorých výskyt závisí od rôznych faktorov, u hospodárskych zvierat hlavne zámernej selekcie. Na tento účel sa využívajú v podstate dve skupiny metód a to metódy
testujúce rozdiely medzi populáciami respektíve plemenami a metódy analyzujúce vnútropopulačné rozdiely.
Z pohľadu medzipopulačných rozdielov sa na identifikáciu selekčných signálov najčastejšie využíva celogenómový skríning fixačného indexu Fst, analýza variability vo
väzbovej nerovnováhe či výpočet integrovaného skóre haplotypov. Na tento účel existuje množstvo programov, ako napríklad PLINK, varLD či balík programu R rehh.
Na obrázku vpravo je výsledok analýzy testovania selekčných signálov, ktoré reflektujú
rozdiely medzi slovenským strakatým a slovenským pinzgauský dobytkom.
Najsilnejšie selekčné signály boli zistené v rodine kazeínových génov a génov KIT a KDR zodpovedných za strakatosť.
V rámci vnútropopulačných rozdielov sa zvyčajne selekčné signály stanovujú na základe distribúcie homozygotných úsekov či variabilite vo väzbovej nerovnováhe.
Na výpočet možno použiť rovnaké programy ako v prípade predchádzajúcich metód. Na obrázku vpravo sú znázornené výsledky testovania homozygotných úsekov
v genóme plemien slovenského strakatého slovenského pinzgauského dobytka. Z výsledkov je zrejmé, že podobne ako pri predchádzajúcom prístupe
sú selekčné signály najsilnejšie v oblasti génov kazeínovej rodiny.
V prípade otázok k tejto prezentácii ma prosím kontaktujte na emailovej adrese uvedenej na snímke dole.
Informácie o projekte, vrátane prístupu k ďalším prezentáciám, nájdete po naskenovaní čiarového kódu vľavo. Ďakujem za pozornosť.