Dobrý deň, v rámci tejto prezentácie si povieme ako riešiť praktické príklady, ktoré sú určené pre modul 2 v rámci inžinierskeho stupňa štúdia.
V rámci praktických príkladov budeme používať na výpočet databázu genotypových
informácií. Túto databázu máte nazdieľanú v priečinku a táto databáza má názov Testset. V rámci databázy sú uložené informácie o mikrosatelitných genetických markeroch.
Celkovo nájdete v tejto databáze genotypy pre 5 mikrosatelitných markerov, celkovo pre 15 zvierat, ktoré sú rozdelené do 3 subpopulácií.
Na výpočet budeme používať program Genalex a našou úlohou bude vypočítať priemernú očakávanú a pozorovanú heterozygotnosť, efektívny počet alel a fixačný index Fis.
v rámci jednotlivých markerov a plemien, čiže subpopulácií v databáze a na základe zistených hodnôt všetkých analyzovaných parametrov popísať úroveň diverzity.
Ďalej bude našou úlohou vypočítať F štatistiku to znamená indexy Fis, Fis a Fst a popísať úroveň diverzity v databáze. Ďalej budeme zisťovať, ktoré plemená
respektíve populácie v databáze sú geneticky najpodobnejšie/ najvzdialenejšie na základe Fst indexu a Neiových genetických vzdialeností
a budeme mať uviesť prečo a poslednou úlohou bude zhrnúť informácie o stave diverzity, respektíve genetickej diferenciácii v databáze na základe výsledkov PCA analýzy.
Keď sa pozriete na samotný priečinok, ktorý obsahuje vstupné informácie, ktoré budete potrebovať na výpočet, tak máte tu jednak samotné zadanie a ďalej tu máte súbor genotypových informácií.
Jedná sa o textový súbor a tak ako som hovorila má názov Testset.
Ďalej tu ešte máte samotný program, ktorý budeme používať na výpočet. Tento program sa volá Genalex. Najprv si tak v skratke povieme, ako sú uložené informácie v súbore Testset.
Tento súbor alebo informácie v ňom sú uložené vo formáte, ktorý sa volá genepop.
Pri genepop formáte v prvom riadku máte ľubovoľnú informáciu o názve databázy alebo o plemene, ktoré hodnotíte a podobne.
Informácia v prvom riadku je ľubovoľná, môžete si tam zadať akúkoľvek informáciu chcete.
V ďalších piatich riadkoch máme informácie o názve genetických markerov, ktoré hodnotíme. V tomto prípade tu máme uvedené len všeobecné názvy loci 1, 2, 3, 4 a 5.
Máme 5 genetických markerov, čiže 5 samostatných riadkov obsahujúcich informácie o ich názve.
V ďalšom riadku máme taký oddeľovač informácie o názve genetických markerov a samotných informácií o genotypoch pre
jedincov v prvej populácii. Takýto riadok môžte vidieť aj nižšie a v podstate oddeľuje jednotlivých jedincov v subpopuláciách, pretože tak ako som hovorila, máme tu tri subpopulácie.
Keď sa pozrieme na prvého jedinca v populácii 1, momentálne je vyznačený modrou farbou, tak v tomto riadku je uložená informácia o identifikačnom čísle jedinca,
ktorá je od genotypových informácií oddelená čiarkou. V stĺpcoch máme potom genotypy pre jednotlivé genetické markery. Máme päť genetických markerov, čiže tu máme
5 stĺpcov. Čo sa týka kódovania informácií o genotype, každý genotyp má 2 alely aj v prípade ak hodnotíme mikrosatelity, ktoré sú viacalelové genetické markery.
Len v tomto prípade tu máme 1 alelu zakódovanú trojicou čísel, čiže trojkombináciou čísel. 262 bude prvá alela a 264 bude druhá alela pre prvý genetický marker jedinca v 1 populácii.
179 bude prvá alela v genotype jedinca 1 v populácii 1 pre druhý genetický marker a 179 bude zase druhá alela v tomto genotype pre druhý genetický marker jedinca 1 v populácii 1.
V prípade ak by ste hodnotili bialelické markery ako napríklad jednonukleotidové polymorfizmy,
kľudne môžte použiť pre kódovanie alel iba 1 číslo, avšak používajte pre označenie alel číselné kombinácie alebo čísla, nie
textové znaky.
Čo sa týka samotného programu, ktorý budeme používať na výpočet, jednak ho nájdete v tomto priečinku, ale tento program si môžete veľmi jednoducho stiahnuť v googli, keď napíšete do
google vyhľadávača Genalex.
Vo výsledkoch vyhľadávania otvoríte prvý link a vyberiete si v hornej časti možnosť download. Červenou farbou textu máte označený zazipovaný súbor, ktorý obsahuje aj tento program.
Keďže tento program pracuje pod windowsom aj pod mac-kom, môžete si stiahnuť aj jednu aj druhú verziu - podľa toho, ktorý systém používate. Okrem toho v tomto priečinku nájdete
aj manuál pre používanie programu Genalex, ktorý je v angličtine. Tento program je voľne dostupný, nie je potrebné zaň platiť a nie je potrebné ho dokonca ani inštalovať.
Takže idem na otvorenie samotného programu. Ja som si ho stiahla, dvojklikom otvorím tento program. Vyzerá podobne ako excel.
Dôležité je pri prvom kroku kliknúť na povoliť makrá, pretože tento program pracuje tak, že sú tam nastavené makrá, ktoré umožňujú výpočet. Kde nájdete program?
Program nájdete buď priamo na lište, ak použijete novšiu verziu alebo v doplnkoch, čiže kliknete na doplnky a tu nájdete názov programu
Genalex. Otvoríte si túto kartu a ako prvý krok, ktorý budeme realizovať je, že budeme importovať dáta. Ako som už hovorila, dáta sú vo formáte genepop čiže kliknem na možnosť genepop.
Teraz sa má program pýta, či mám samostatný genepop súbor alebo chcem načítať priečinok s viacerými genepop súbormi. Ja mám samostatný.
Viem, že moje dáta majú codominantný charakter, takže tu nič nemením a klikneme na OK.
Teraz mi vyskočí dialógové okno. V rámci dialógového okna si musím vybrať umiestnenie môjho priečinka s genepop súborom. Ja mám môj priečinok
s genotypovými dátami uložený uložený na pracovnej ploche, čiže ja si ho najprv vyhľadám.
No a iba dvojklikom ho otvorím. Teraz sa ma program opýta či chcem uložiť takýto excel aj s výsledkami. Môžem ho dať samozrejme uložiť aj nemusím. Závisí to odo mňa.
Ja si ho nebudem dávať ukladať, pretože dosiahnuť alebo načítať genotypový súbor do programu Genalex a následne aj vypočítať výsledky naozaj netrvá dlho,
hlavne v prípade ak moja databáza obsahuje relatívne nízky počet genotypových záznamov. Po načítaní
mám tu uložené presne tie isté informácie ako v súbore genepop až na to, že tieto informácie mám troška inak rozložené. V prvom riadku mám informáciu o počte genetických markerov,
o celkovom počte hodnotených jedincov, o počte subpopulácií a následne v stĺpci D, E a F mám informáciu o počte jedincov v rámci každej subpopulácie.
V ďalšom riadku mám informáciu o názve môjho súboru, o spôsobe, ako som ho importovala do programu Genalex a ďalej tu mám
uvedenú informáciu o názve jednotlivých populácií. Ak chcem, môžem si to samozrejme zmeniť na názvy plemien, ktoré v mojej analýze testujem.
V ďalšom riadku mám hlavičku stĺpcov nižšie, to znamená, že tu mám uvedené informácie o identifikačnom čísle jedinca, o príslušnosti jedinca
k jednotlivým populáciám a tu mám genotypové informácie pre každý jeden genetický marker pre konkrétneho jedinca.
Idem na výpočet samotných parametrov genetickej diverzity. Prvou úlohou bolo, aby som vypočítala pozorovanú
a očakávanú heterozygotnosť, efektívny počet alel a ďalšie parametre, ktoré sa týkajú genetickej diverzity.
Takže v prípade ak mám načítané dáta opätovne kliknem na možnosť Doplnky, ďalej na program Genalex a keďže všetky tieto parametre sú založené na frekvencii alel, otvorím si možnosť Frequency.
Program sa ma v tomto dialógovom okne pýta, či chcem použiť na výpočet všetky genetické markery, všetky vzorky, všetky populácie
a samozrejme sa ma aj pýta o aký typ dát sa jedná. Sú to codominantné dáta, takže v tomto prípade v tomto okne nič nemením, iba kliknem na možnosť OK.
V tomto dialógovom okne mám možnosť si vybrať typ analýzy, ktorú chcem realizovať. Keďže nás zaujíma primárne heterozygotnosť a Wrightov fixačný index Fis
za jednotlivé populácie označím si iba možnosť het , fstat, poly by pop. Keďže viem, že ešte budem potrebovať počítať aj genetickej vzdialenosti (to sa týka hlavne úlohy 3)
odkliknem si aj Neiove genetické vzdialenosti a párové Fst.
v tretej časti tohto dialógového okna a kliknem na OK.
Program mi spočítal výsledky a vygeneroval 3 nové excelovské hárky. Keď sa pozriete dole na toto okno excelovské hárky majú názvy HFP, NeiP a FstP.
V hárku HFP nájdem informáciu o genetických parametroch, ktoré sa týkajú hlavne diverzity a tie ktoré potrebujem na vypracovanie úlohy číslo 1. V hárku NeiP nájdem maticu genetických vzdialeností
počítanú podľa Neia a v hárku FstP nájdem maticu genetických vzdialeností počítaných alebo odvodených od Wrightovho fixačného indexu Fst. Takže prejdem späť na hárok HFP.
V tomto hárku mi program vždy vygeneruje aj informáciu o tom, čo je v tomto hárku vlastne uložené. Čiže v prvom riadku mám názov štatistiky,
ktorú som použila na výpočet parametrov alebo použitú možnosť v rámci programu.
Počítala som heterozygoť, F štatistiku a polymorfizmus za populácie pre kodominantné dáta. Nižšie pod tým mám informáciu znova opätovne o súbore, ktorý som hodnotila.
V riadku 10 mám hlavičku alebo rozpísané skratky, ktoré sú uvedené v hlavičke v riadku 12. To znamená, že N je veľkosť populácie, Na je počet alel, Ne je efektívny počet alel, I je informačný index,
Ho je pozorovaná heterozygotnosť, He je očakávaná heterozygotnosť, uHe je nezávislá očakávaná heterozygotnosť a F je fixačný index Fis.
Program prepočítal tieto parametre samostatne za každú populáciu a každý genetický marker. Ale mňa zaujíma
hlavne priemer a tieto priemerné hodnoty sú uvedené v riadku 31 v tomto prípade, kde tu vidím priemernú hodnotu
počtu zvierat v rámci každej populácie, priemernú hodnotu počtu alel pre každý genetický marker v rámci každej populácie, priemernú hodnotu pre efektívny počet
alebo pozorovanú heterozygotnosť, očakávanú heterozygotnosť a Wrightov fixačný index Fis. Na základe týchto hodnôt
jednak viem porovnať jednotlivé populácie navzájom a potom ešte program vypočíta aj štandardnú chybu.
Mňa teda ale zaujímajú iba priemerné hodnoty. Čiže na základe efektívneho počtu alel by som mohla povedať, že v rámci týchto troch hodnotených populácií je miera diverzity najvyššia
v prípade populácie 1, pretože táto dosiahla najvyššiu priemernú hodnotu efektívneho počtu alel. Keď sa pozriem
na heterozygotnosť (zaujímajú ma však iba priemerné hodnoty) tak v rámci heterozygotnosti pozorovanej
najvyššiu mieru dosiahla populácia číslo 2, čiže v tomto prípade z týchto troch hodnotených populácií je heterozygotnosť najvyššia v populácii číslo 2. Ale pri očakávanej vidím,
že najvyššie číslo očakávanej heterozygotnosti bolo zistené v rámci populácie číslo 1. Keď sa však pozriem globálne na výsledky,
vidím, že hodnota heterozygotnosti je vyššia ako 0,5, to znamená v rámci všetkých troch populácií môžeme pozorovať
vyšší podiel heterozygotných genotypov oproti homozygotným. V poslednom stĺpci mám Wrightov fixačný index Fis. Keďže tento index môže nadobúdať hodnoty od -1 po 1,
pričom záporné hodnoty signalizujú zvýšený podiel heterozygotných jedincov v populácii oproti homozygotným, môžem konštatovať,
že tak ako mi to naznačovala pozorovaná heterozygotnosť miera diverzity je
naozaj najvyššia v populácii číslo 2 z týchto troch mnou hodnotených populácií. V prípade, ak by som potrebovala hodnotiť celkový priemer za všetky
tri populácie, tento je uvedený nižšie. Nájdem ho v tejto časti výsledkov. V rámci ďalšej úlohy
mám počítať Wrightove fixačné indexy Fis, Fit a Fst. Nájdem ich v tejto tabuľke. Sú uvedené nižšie, začínajú v mojom prípade od riadku 47, kde mám napísané
F štatistika a odhady počtu migrantov za všetky populácie a všetky lokusy. Pozriem sa na celkový priemer, pretože ten ma naozaj zaujíma a na základe týchto hodnôt môžem povedať,
že aj napriek tomu, že v rámci metapopulácie je zvýšený podiel homozygotných jedincov, keď sa pozerám na subpopulácie ako celky Fis index
dosahuje zápornú hodnotu, to znamená, že naozaj v rámci každej subpopulácie je zvýšený podiel heterozygotných jedincov.
Index Fst mi naviac naznačuje, že naozaj miera genetickej diferenciácie v mnou hodnotených populáciách je pomerne dobrá. V tomto hárku mám uložené aj rôzne ďalšie informácie,
ako je napríklad percento polymorfných lokusov a mám tu súčasne aj vzorce, ktoré boli použité na výpočet, čiže je to dobré v prípade,
ak by ste to potrebovali uviesť napríklad v Materiály a metodiky, ak by ste tento program používali pri vypracovaní vašej záverečnej práce.
Ďalšou našou úlohou je spočítať, aké sú genetické vzdialenosti medzi populáciami a to jednak na základe indexu Fst a na základe Neiových genetických vzdialeností. V hárku NeiP
sú uvedené vzdialenosti počítané na základe Neiových genetických vzdialeností. Mám tu dve matice: prvá matica je matica, ktorá mi vyjadruje Neiovu
genetickú vzdialenosť a druhá matica mi vyjadruje Neiovu genetickú podobnosť. Aj keď som v teoretickej časti hovorila, že Neiove genetické vzdialenosti nadobúdajú hodnoty od 0 po 1,
závisí to samozrejme od metodiky, ktorá bola použitá na ich výpočet, pretože okrem štandardnej Neiovej genetickej vzdialenosti existujú aj rôzne modifikácie
tohto vzorca, napr. v závislosti od typu markerov, ktorý použijete na analýzu.
V tomto prípade platí, keďže sa jedná o maticu, že toto číslo mi vyjadruje genetickú vzdialenosť medzi populáciu 1 a populáciou 1.
Keďže sa jedná o tú istú populáciu, toto číslo musí byť rovné 0 (lebo sú geneticky identické).
Keď sa pozriem nižšie, toto číslo mi vyjadruje genetickú vzdialenosť medzi populáciu 1 a populáciou 2.
Vidím, že tu už to číslo je pomerne vysoké a aj najvyššie z týchto troch čísel v matici, čiže genetických vzdialeností medzi jednotlivými populáciami.
Ešte sa môžem pozrieť na tretie číslo, ktoré mi vyjadruje genetickú vzdialenosť medzi populáciou 1 a populáciou 3.
Vidím, že tieto 2 populácie sú z mnou hodnotených populácií geneticky najpodobnejšie, pretože pozorované číslo je, jednoducho povedané, najnižšie.
Idem na hárok FstP. V hárku FstP mám uvedené rovnako genetické vzdialenosti
ale odvodené na základe Wrightovho fixačného indexu Fst. Platí to isté ako v prípade Neiových genetických vzdialeností. To znamená, že čím bližšie je hodnota indexu k 0,
tým viac sú si populácie geneticky navzájom podobnejšie. Keď sa pozriem na výsledky, ktoré som získala, zistím, že naozaj geneticky najpodobnejšie sú populácie 1 a 3.
V rámci poslednej úlohy máme vyhodnotiť jednak stupeň genetickej diverzity v hodnotených populáciách a súčasne aj stupeň genetickej diferenciácie.
Ale ešte v poslednej úlohe mám túto analýzu realizovať aj pomocou analýzy hlavných komponentov. Ako na to? Tak v tomto prípade už to nemám uložené v hárkoch,
ktoré som si vygenerovala v prvom kroku, ale musím sa vrátiť späť na hárok Testset a musím si spočítať
genetické vzdialenosti na úrovni jedincov a následne realizovať analýzu základných alebo hlavných komponentov. Genetické vzdialenosti na úrovni jedincov si vypočítam
pomocou programu Genalex tak, že zakliknem možnosť Distance a vyberiem si možnosť Genetic. Program vygeneruje dialógové okno. V rámci dialógového okna sa ma pýta
ako chcem počítať genetické vzdialenosti. Pre tento príklad si kľudne nechajte zakliknutie možnosti, ktoré sú prednastavené. Klikneme na možnosť Ok.
Program spočítal genetické vzdialenosti a môžem ísť na samotnú analýzu hlavných komponentov. Túto nájdem v možnosti PCoA, kde si zakliknem analysis.
Zase v dialógovom okne nechám prednastavené všetky parametre, tak ako sú, ale zmením iba nastavenie grafických možností, pričom namiesto Data labels,
čo znamená, že mi pri každom jedincovi vloží do obrázka jeho identifikačné číslo, si zaklikneme možnosť Color code pops. To znamená,
že každý jedinec alebo jedince v rámci každej populácie budú odlíšené inou farbou a kliknem na OK.
Analýza je pomerne rýchla a naviac mi ešte produkuje grafy, čo je naozaj veľmi dobré v prípade ak chcete takéto
výsledky použiť do seminárnej alebo záverečnej práce. Keď sa pozriem na výsledky analýzy, tak v prvej
časti hárku sú zase uvedené formálne informácie o tom, čo som hodnotila, akým spôsobom som to hodnotila, koľko mám populácii, koľko mám jedincov.
Nižšie mám uvedené aj informácie o tom koľko percent genetickej variability
vyjadruje ktorý základný komponent. Vo všeobecnosti platí, že prvé dva základné komponenty mi vyjadrujú najväčší podiel variability v mnou hodnotenom súbore.
Tuto vidím, že spolu prvé dva komponenty vyjadrujú 42% variability, to znamená, že naozaj dobre definujú genetickú variabilitu v mojom súbore.
Keď sa pozriem na výsledok (ten mám graficky znázornený na obrázku vedľa) vidím, že populácie mi vytvárajú
naozaj samostatné genetické skupiny, čo potvrdzuje aj priemernú hodnotu Wrightovho fixačného indexu Fst, ktorá nám identifikovala, že populácie sú dobre geneticky diferencované.
Môžeme povedať, že aj keď je tam určitá miera príbuznosti, pretože sa jedná o ten istý druh, tak populácie vieme spoľahlivo rozlíšiť.
To by bolo z tejto prezentácie všetko. V prípade, ak budete mať ďalšie otázky prosím neváhajte ma kontaktovať a
napíšte mi email na moju emailovú adresu, ktorú nájdete v rámci teoretickej prezentácie. Ďakujem za pozornosť.