Ukážeme si, jak se orientovat v genomické
databázi a využívat různé bioinformatické
nástroje k získávání relevantních
genomických informací včetně genové
sekvence, její struktury a funkční
anotace. Toto cvičení přispěje
k lepšímu pochopení průzkumu genu v
kontextu bioinformatiky a jeho
potenciálního využití v genetice zvířat.
Jako první využijeme databázi GenBank. Do
vyhledávacího pole zapíšeme název
genu RYR1 a označení
druhu prase, pig a dáme
vyhledat. Po chvíli se nám
zobrazí výsledky.
Vidíme zde informaci o genu tady je
jedna, ale rovněž i o její
mediátorové RNA.
Vidíme zde jedinečné číslo genů
jeho ID.
A kliknutím na název genu se dostaneme
na podrobnější informace.
Vidíme, že gen se nachází na
6. chromozomu a máme zde informace o dvou
genomických sestavení. Jedno
starší 105 anotace a jedno
novější 106. Na
konci tabulky jsou přesné pozice v
nukleotidech v rámci genomu našeho
genu RYR1.
Níže je grafické znázorněna pozice našeho
genu RYR1 a genů,
které sousedí s tímto genem
napravo a nalevo.
Dále zde vidíme grafické znázornění
struktury genu. Včetně
pozic jednotlivých exonů
a intronů. Najetím
kurzorem myši na tuto sekvenci
vidíme další podrobnosti a možnost
stáhnout si dílčí sekvence.
Jedná se o sekvenci uvedenou v databázi
GenBank NCBI.
Dále zde vidíme další sekvenci téhož
genu uvedenou v databázi Ensemble.
Můžeme se zde dočíst o informacích, jako
že to je strukturní gen,
jaký protein kóduje?
Jaká je jeho délka a další?
Pokud si dole na odkazy,
klikneme na záznam Fasta,
Fasta record,
dostaneme se do vlastní sekvence.
Vidíme, že se opravdu jedná o
genomickou sekvenci celogenomové shotgun
sekvence. Z genomu
SusScrofa 11.1 a to v
pozicích našeho vybraného regionu s genem
RYR1.
Vidíme, že sekvence je opravdu dlouhá.
Ryr1 ge patří mezi nejdelší geny.
Další informace k této sekvenci získáme
rozbalením menu Fasta.
Která nám nabízí různé možnosti,
stažení v různých formátech této
sekvence. Když se
vrátíme zpět na
informacích ke genu RYR1
a skrolujeme trochu níže vidíme
informace o expresních datech.
Vidíme, že tento gen je nejvíce
exprimován v kosterní svalovině.
Přičemž se jedná o výsledky z různých
publikací.
Další informace o funkci tohoto
genu najdeme níže.
Zejména si všimněme, že se jedná o gen,
který zahrnuje transport vápnikových iontů,
a to v sarkoplazmatickém retikulu svalové
buňky. Na to dále navazují
informace o proteinu o jeho funkcích.
Mimo jiné se tam dočteme, že se to týká
prasečího stresového syndromu.
A že se v podstatě jedná o
protein s funkcí vápníkového
kanálu.
Ještě o něco níže jsou zobrazeny
informace o referenčních sekvencích
transkriptů, které byly zase popsány v
literatuře. A uložených do
databáze GanBank.
V poslední části můžeme vidět
genomické nebo mRNA sekvence,
které mohou souviset nebo souvisí s
genovou sekvencí RYR1 genu u
prasete.
Jako poslední tam můžeme vidět odkaz
na protein RYR1 genu do
databáze Uniprot.
My se však vrátíme zpět nahoru a
klikneme si na odkaz GenBank
vpravo.
Čímž se dostaneme do referenční sekvence
oblasti genu.
Najdeme zde její jedinečné číslo,
dále informaci, o jaký druh se jedná.
Dále jakou má délku tato sekvence.
Vidíme, že přes 118000 párů
bazí. No, a když se
posuneme ještě níže, tak vidíme
informaci o genu.
Jak je dlouhý a dále o jednotlivých
úsecích, které potom tvoří
transkribovanou mRNA, to znamená
tam jsou ty kódující sekvence.
A když klikneme na mRNA.
Vyznačí se nám všechny tyto kódující,
exonové sekvence v rámci genomové
sekvence.
A když klikneme na CDS
čili kódující sekvence.
Tak se nám vyznačí pouze ty,
které ty části sekvence
sekvencí, které budou
translantovány, to znamená překládány do
proteinů.
A vidíme, že opravdu prvním tripletem,
první trojicí bazí
je ATG, což v řeči mRNA
znamená AUG, což je ten iniciační kód
kódující první aminokyselinu v každém
proteinu, methionin.
Protože tento gen je opravdu velmi
dlouhý, také kodující protein
tohoto genu je poměrně dlouhý.
Jeho sekvenci zde také můžeme vidět.
A to včetně jeho identifikačního čísla.
Pokud se vrátíme na začátek
našeho vyhledávání,
můžeme si kliknout na odkaz na
sekvenci mediátorové RNA.
Tady jak vidíte, má přes 15 tisíc párů bazí.
I zde se jedná o referenční sekvenci,
které má své jedinečné číslo.
Referenční sekvence znamená, že byla
sestavena z mnoha dílčích sekvencí mRNA
od různých autorů.
I zde máme různé informace, mimo jiné
i o proteinu, o jeho
sekvenci. A když
klikneme na CDS odkaz, dostaneme kódující
část této sekvence, to znamená ta, která
kóduje tento protein. Protože se
jedná o mRNA, nejsou zde žádné
introny a máme 1 velký celek.
Přesto i zde jsou vyznačeny
jednotlivé exony, z kterých tato mRNA
je tvořena.
Druhou genomickou databázi, kterou se budeme
zabývat, je ENSEMBL.
Je to opět veřejná databáze,
ve které jsou obratlovci.
Když si rozvineme roletku,
můžeme vyhledat různé
druhy, samozřejmě včetně člověka.
A můžeme si tam nalézt náš
zkoumaný druh, prase.
Do vyhledávacího pole opět zadáme název
neboli zkratku toho našeho genu RYR1.
A za chvíli nám se ukáže mnoho výsledků.
Nás zase bude zajímat referenční
sekvence.
Jinak zde najdeme i další jiné zdroje
informací, sekvence od
jiných autorů, respektive i
jednotlivých plemen prasat, u
kterých tatáž sekvence byla zjišťována.
Na další straně ve výsledcích
vidíme zase podobné informace, to znamená
informace o genomu, kde se gen nachází -
zase vidíme 6. chromozom, v jakém
rozmezí se sekvence,
ten náš gen nachází?
A v grafickém zobrazení vidíme zase
výsledky různých studií, které
sekenovaly tentýž gen.
My se ale podíváme na nabídku
vlevo nahoře. Kde
je struktura, v které si vybereme část
Ontologies, a podíváme se
na informace k
molekulárním funkcím.
Kde vidíme vlastně podobné funkce, které
byly v databázi Genbank. Zde se jedná
o stejné funkce.
Dále se podíváme na biologické
procesy. Opět se jedná o
stejné informace. Jedná se o
protein, který je zahrnut do transportu
vápníku
a o transmebránový transport.
A procesy v na úrovni buňky
se opět jedná o
membránový protein, trans membránový
protein, který se nachází v
sarkoplasmatické retikulu.
V části Genetic variantion nás bude
zajímat, jaká byla již popsána
variabilita v tomto genu.
V tabulární formě pak můžeme
vidět velké množství
mutací. Zejména se
jedná o jednoduché polymorfismy SNP,
ale taky delece nebo inzerce.
A to již od začátku genu.
Dále v rámci intronů a exonů.
Jsou zde informace o konkrétní pozici
tohoto polymorfismu.
K jaké tam dochází k alternaci nukleotidů,
a co je to za typ
variability.
Nejzajímavějąí jsou vak mutace, které
jsou součástí exonu, a to zejména
misssence - varianty, které mohou
způsobovat záměnu aminokyselin.
Nás bude zajímat SNP, které způsobuje
zaměnu aminokyselin na pozici 612.
Jedná se o mutaci, která byla popsána v
publikaci Fuji et al. v roce
1991.
Ta je právě asociována s
citlivostí prasat na stres,
takzvanou maligní hypertermií.
Abychom tuto mutaci mohli identifikovat v
genomu, využijeme sekvenci
popsanou v této publikaci,
kterou si zkopírujeme a vložíme do nového
souboru v textovém editoru.
Dále z genomické sekvence si ve Fasta
formátu stáhneme sekvenci
genu. A tuto
sekvenci si zkopírujeme do
schránky.
A protože opravdu dlouhá, bude nám to
chvíli trvat, než si označíme celou
sekvenci.
Tuto sekvenci si opět můžeme vložit do
samostatného souboru textového, abychom s
ní mohli nadále pracovat.
Jako hlavní nástroj pro vyhledání oblasti
v genomu, kde se nachází naše
mutace, použijeme nástroj
BLAST, který provede lokální
aliment ze sekvence z publikace
s genomovou sekvencí.
Proto si zaškrtneme alignmentovat 2 a více
sekvencí. Do
horního okénka vložíme naši genomovou
sekvenci a do spodního tuto
sekvenci z
publikace.
Necháme zaškrtnutou nabídku,
Highly simillar sekvences Megablast
a zaškrtneme nabídku, aby se nám výsledek
objevil v novém okně. Kliknutí na
BLAST se nám spustí vyhledávání.
V novém okně ve výsledcích vidíme v
tabulce nejprůkaznější
alignmenty, v našem případě pouze jeden.
A když si na něj klikneme, uvidíme
výsledek přiřazení
naší sekvence z publikace s celogenovou
sekvencí. Naše sekvence má 74
párů bazí. A celogenomová
sekvence začínají na
18176 bázi a
končí na 18249
bázi. My si zkopírujeme
výsledek do Wordu, aby se nám lépe
pracovalo s textem.
Označíme si místo mutace C/T.
A to je právě ta pozice našeho SNP,
které způsobuje záměnu aminokyselin,
protože je to 1 báze v tripletu
TGC nebo CGC.
Z publikace totiž víme, že varianta CGC
nám představuje původní dominantní
alelu velké N, která způsobí, že na
pozici 615 aminokyseliny je arginin.
Varianta s mutací T čili TGC
způsobuje zaměnu aminokyselin na
cystein a to nám představuje
recesivní alelu n, homozygotní jednici s
touto mutací jsou náchylní na stres.
Děkuji za pozornost.