Dobrý den. V této přednášce se budeme
zabývat genetickým testováním rodičovství
u zvířat. Přednáška je součástí modulu
4, Precizní chov hospodářských zvířat.
Vytvoření této prezentace bylo podpořeno
grantem Erasmus+ KA2 v rámci
projektu ISAGREED, Inovace
obsahu a struktury studijních programů v
oblasti managementu živočišných,
genetických a potravinových zdrojů s
využitím digitalizace.
Na úvod je potřeba vysvětlit základní
pojmy, které budou během této přednášky
používány. Prvním z nich je parentika,
česky řečeno rodičovství. Ověřuje se tedy
správnou obou rodičů, otce i matky.
V případě paternitiny je u jedince ověřována
pravost pouze otci, což má největší význam
u lidí. Pokud budeme provádět
identifikaci jedince, budeme pomoci
molekulárně genetických metod (tzv.
molekulární daktyloskopie) určovat, zda
vzorek, DNA patří zkoumanému
jedinci. Pojem genetický typ nebo též
genetický profil představuje soubor
všech alel nebo genotipů, který je
charakteristický, nezaměnitelný a
unikátní pro každého jedince.
Smyslem genetického testování rodičovství
je ověření původu a identifikace jedince.
V případě hospodářských zvířat chovaných v
České republice se testování řídí zákonem
číslo 154/2000 sbírky,
zákonem o šlechtění, plemenitbě a evidenci
hospodářských zvířat, takzvaným
plemenářským zákonem. U prasat se určuje
genetický typ kanců ve šlechtitelských
chovech, u skotu se ověřuje původ plemených
býků a určuje se jejich genetický tip před
výběrem pro plemenitbu, u koní se ověřuje
původ hříbat po inseminaci.
Určení rodičovství má velký význam nejen
v genetice zvířat, ale i forenzní genetice
a medicíně. V chovatelských záznamech
a rodokmenech se vyskytují chyby, které by
mohly způsobit nepřesnost odhadu plemenné
hodnoty. Cena zvířat se často odvíjí od
genetické kvality jejich rodičů, a proto
je třeba mít možnost rodičovství ověřit.
Může docházet i k oklamání zákazníků.
V oblasti forenzní genetiky se běžně řeší
paternitní spory a mnoho pachatelů je v
současnosti usvědčeno na základě stopy
DNA. I oběti násilných trestných činů
či přírodních katastrof mohou být
identifikovány na základě jejich DNA.
Ověření příbuznosti je nutnosti především
u transplantací.
V minulosti před rozvojem molekulárně
genetických metod se k ověřování
parentity používaly krevní skupiny a
následně variabilita bílkovin. Tyto
metody byly ale málo spolehlivé, proto se
začaly používat metody založené na
detekci variability DNA neboli DNA fingerprinting,
nejprve byly založené na variabilním počtu
tandemových repetic, tzv. VNTR
u minisatelitů. Aktuálně se využívá
metod spojených s amplifikací DNA pomocí PCR,
tzv. STR, což jsou mikrosatelity.
Výhodou je to, že pro analýzu stačí
velmi malé množství biologického
materiálu. Tato nejrozšířenější metoda
bude předmětem následujícího výkladu.
Stále častěji se také využívá detekce
jednonukleotidových polymorfizmů, tzv. SNP
ve spojení s moderními velkoformátovými
metodami testování zvířat.
Základními požadavky pro moderní metody
je vysoká spolehlivost zamítnutí, a nebo
potvrzení rodičovství, rychlost a
jednoduchost testování, vysoká
reprodukovatelnost a v neposlední řadě co
nejnižší cena.
Už jsou to mikrosatelity? Jsou to krátké
repetitivní sekvence, tzv. tandemové
repetice, které se skládají z
mono, di, tri nebo tetra nukleotidových motivů.
Jsou vysoce polymorfní, to znamená počet
jejich alelických forem je velmi
vysoký. Řadíme je mezi délkové
polymorfismy. Sekvenci s mikrosatelity
můžeme amplifikovat pomocí PCR
a elektrofrézou poté detekovat jejich
délku, která je dána rozdílným počtem
repetic. Označení ale jednotlivých
mikrosatelitů je dáno velikostí této
sekvence v počtech bází.
Na schématu vidíte ukázku pouze 3
alel jednoho mikrosatelitu, které se liší počtem
opakování repetice GC
a velikost jejich PCR produktu se tak
liší, přičemž jejich kombinace mohou dát
celkem 6 různých genotipů. Velikost
alely zjistíme elektroforézou, zde je pro
názornost schéma gelové elektroforézy.
U různých druhů zvířat se používají různé
sady mikrosatelitů neboli panely
v minimálním počtu 10, což je dostatečné
pro vysoce spolehlivé ověření parentity.
U člověka se používá pro paternitu 15 až
22 těchto markerů.
Jsou vyvíjeny i další panely
mikrosatelitů pro jiné druhy zvířat a
umožňují kromě testu parentity i studovat
genetickou diverzitu populace.
Na tomto obrázku vidíte jednotlivé kroky
ověření rodičovství u zvířat pomocí
mikrosatelitů. Izolace DNA je možná z
jakéhokoliv biologického materiálu, který
obsahuje byť minimální množství DNA.
Následuje multiplexní PCR reakce, která
specificky namnoží jednotlivé
mikrosatelity dohromady v 1 zkumavce.
Jejich velikost je pak určena pomocí
přesné kapilární elektroforézy. Následuje
určení alel pro jednotlivé mikrosatelity.
Srovnáním genetického typu rodičů a
potomka je možné ověřit rodičovství.
Podstatou multiplexní PCR je to,
že během 1 reakce dochází k namnožení
více fragmentů DNA a to v závislosti na
počtu primerů přidaných do reakce. Jeden z
primerů daného páru musí být vždy označen
specifickou fluorescenční barvou. Při
designu primerů je třeba dbát na to, že
rozsahy velikostí alel různých
mikrosatelitů v jedné barvě se nesmí
překrývat, jinak by nebylo možné je
navzájem rozlišit. Reakce probíhá v
termálním cykleru. Výsledkem je
mikrozkumavka obsahující amplikony
různých délek a lze tak celou analýzu
provést v 1 zkumavce.
Směs PCR fragmentů mnoha různých
mikrosatelitů je třeba rozlišit podle
velikosti a barvy. K tomu slouží
fluorescenční kapilární elektroforéza. Ta
umožňuje velmi přesné určení velikosti
jednotlivých fragmentů, tzn. alel
a provádí se pomocí genetického analyzátoru.
Konkrétní velikost jednotlivých alel je
určena pomocí srovnání s kalibrační
křivkou velikostního standardu. To je
směs DNA fragmentů známé délky.
Velikostní standard se separuje vždy s
každým vzorkem dohromady a rozliší se
pomocí oranžové barvy.
Výsledek elektroforézie můžeme sledovat
pomocí surových dat. Na
elektroforetogramu vidíme píky, které
odpovídají jednotlivým mikrosatelitům
(červené, modré, zelené a černé)
a velikostnímu standardu, který je oranžový.
Software genetickýho analyzátoru umožňuje
automatické vyhodnocení - určení velikosti
jednotlivých píků, které odpovídají alelám.
Získáme tak genotyp jednotlivých
mikrosatelitů jedince, tzv.
genetický typ. Srovnáním s rodiči
můžeme ověřit rodičovství nebo srovnáním s
jiným vzorkem provést identifikaci
jedince.
A to je vše k této krátké prezentaci
vysvětlující genetické testování
rodičovství u zvířat. Pro ukázku
praktického provedení analýzy sledujte
prezentaci Laboratorní příklady. Děkuji
za pozornost.