1
00:00:00,591 --> 00:00:02,876
Dobrý den. V této přednášce se budeme

2
00:00:02,876 --> 00:00:05,120
zabývat genetickým testováním rodičovství

3
00:00:05,120 --> 00:00:07,766
u zvířat. Přednáška je součástí modulu

4
00:00:07,766 --> 00:00:10,010
4, Precizní chov hospodářských zvířat.

5
00:00:10,652 --> 00:00:13,057
Vytvoření této prezentace bylo podpořeno

6
00:00:13,057 --> 00:00:15,982
grantem Erasmus+ KA2 v rámci

7
00:00:15,982 --> 00:00:18,708
projektu ISAGREED,  Inovace

8
00:00:18,708 --> 00:00:20,672
obsahu a struktury studijních programů v

9
00:00:20,672 --> 00:00:22,396
oblasti managementu živočišných,

10
00:00:22,396 --> 00:00:24,680
genetických a potravinových zdrojů s

11
00:00:24,680 --> 00:00:25,923
využitím digitalizace.

12
00:00:27,957 --> 00:00:29,841
Na úvod je potřeba vysvětlit základní

13
00:00:29,841 --> 00:00:31,885
pojmy, které budou během této přednášky

14
00:00:31,885 --> 00:00:34,490
používány. Prvním z nich je parentika,

15
00:00:34,771 --> 00:00:37,336
česky řečeno rodičovství. Ověřuje se tedy

16
00:00:37,336 --> 00:00:39,701
správnou obou rodičů, otce i matky.

17
00:00:40,182 --> 00:00:42,386
V případě paternitiny je u jedince ověřována

18
00:00:42,386 --> 00:00:45,192
pravost pouze otci, což má největší význam

19
00:00:45,192 --> 00:00:47,156
u lidí. Pokud budeme provádět

20
00:00:47,156 --> 00:00:49,481
identifikaci jedince, budeme pomoci

21
00:00:49,481 --> 00:00:51,565
molekulárně genetických metod (tzv.

22
00:00:51,685 --> 00:00:54,270
molekulární daktyloskopie) určovat, zda

23
00:00:54,270 --> 00:00:55,713
vzorek, DNA patří zkoumanému

24
00:00:55,713 --> 00:00:58,238
jedinci. Pojem genetický typ nebo též

25
00:00:58,238 --> 00:01:00,563
genetický profil představuje soubor

26
00:01:00,563 --> 00:01:02,728
všech alel nebo genotipů, který je

27
00:01:02,728 --> 00:01:04,772
charakteristický, nezaměnitelný a

28
00:01:04,772 --> 00:01:06,455
unikátní pro každého jedince.

29
00:01:08,840 --> 00:01:11,044
Smyslem genetického testování rodičovství

30
00:01:11,044 --> 00:01:13,369
je ověření původu a identifikace jedince.

31
00:01:13,810 --> 00:01:15,654
V případě hospodářských zvířat chovaných v

32
00:01:15,654 --> 00:01:18,019
České republice se testování řídí zákonem

33
00:01:18,019 --> 00:01:20,784
číslo 154/2000 sbírky,

34
00:01:21,385 --> 00:01:23,870
zákonem o šlechtění, plemenitbě a evidenci

35
00:01:23,870 --> 00:01:26,035
hospodářských zvířat, takzvaným

36
00:01:26,035 --> 00:01:28,760
plemenářským zákonem. U prasat se určuje

37
00:01:28,760 --> 00:01:30,724
genetický typ kanců ve šlechtitelských

38
00:01:30,724 --> 00:01:33,089
chovech, u skotu se ověřuje původ plemených

39
00:01:33,089 --> 00:01:35,334
býků a určuje se jejich genetický tip před

40
00:01:35,334 --> 00:01:37,859
výběrem pro plemenitbu, u koní se ověřuje

41
00:01:37,859 --> 00:01:38,180
původ hříbat po inseminaci.

42
00:01:42,649 --> 00:01:45,013
Určení rodičovství má velký význam nejen

43
00:01:45,013 --> 00:01:47,619
v genetice zvířat, ale i forenzní genetice

44
00:01:47,619 --> 00:01:49,984
a medicíně. V chovatelských záznamech

45
00:01:49,984 --> 00:01:52,469
a rodokmenech se vyskytují chyby, které by

46
00:01:52,469 --> 00:01:54,513
mohly způsobit nepřesnost odhadu plemenné

47
00:01:54,513 --> 00:01:57,038
hodnoty. Cena zvířat se často odvíjí od

48
00:01:57,038 --> 00:01:59,443
genetické kvality jejich rodičů, a proto

49
00:01:59,443 --> 00:02:01,367
je třeba mít možnost rodičovství ověřit.

50
00:02:01,928 --> 00:02:04,693
Může docházet i k oklamání zákazníků.

51
00:02:04,693 --> 00:02:06,898
V oblasti forenzní genetiky se běžně řeší

52
00:02:06,898 --> 00:02:09,263
paternitní spory a mnoho pachatelů je v

53
00:02:09,263 --> 00:02:11,227
současnosti usvědčeno na základě stopy

54
00:02:11,227 --> 00:02:14,103
DNA. I oběti násilných trestných činů

55
00:02:14,103 --> 00:02:16,107
či přírodních katastrof mohou být

56
00:02:16,107 --> 00:02:18,191
identifikovány na základě jejich DNA.

57
00:02:18,832 --> 00:02:21,157
Ověření příbuznosti je nutnosti především

58
00:02:21,197 --> 00:02:22,079
u transplantací.

59
00:02:24,664 --> 00:02:26,548
V minulosti před rozvojem molekulárně

60
00:02:26,548 --> 00:02:28,712
genetických metod se k ověřování

61
00:02:28,712 --> 00:02:31,037
parentity používaly krevní skupiny a

62
00:02:31,037 --> 00:02:33,482
následně variabilita bílkovin. Tyto

63
00:02:33,482 --> 00:02:36,007
metody byly ale málo spolehlivé, proto se

64
00:02:36,007 --> 00:02:37,771
začaly používat metody založené na

65
00:02:37,771 --> 00:02:40,737
detekci variability DNA neboli DNA fingerprinting,

66
00:02:40,737 --> 00:02:43,663
nejprve byly založené na variabilním počtu

67
00:02:43,663 --> 00:02:45,987
tandemových repetic, tzv. VNTR

68
00:02:45,987 --> 00:02:48,953
u minisatelitů. Aktuálně se využívá

69
00:02:48,953 --> 00:02:51,879
metod spojených s amplifikací DNA pomocí PCR,

70
00:02:51,919 --> 00:02:54,916
tzv. STR, což jsou mikrosatelity.

71
00:02:56,028 --> 00:02:57,872
Výhodou je to, že pro analýzu stačí

72
00:02:57,872 --> 00:02:59,274
velmi malé množství biologického

73
00:02:59,274 --> 00:03:01,759
materiálu. Tato nejrozšířenější metoda

74
00:03:01,759 --> 00:03:03,603
bude předmětem následujícího výkladu.

75
00:03:04,325 --> 00:03:06,529
Stále častěji se také využívá detekce

76
00:03:06,529 --> 00:03:09,215
jednonukleotidových polymorfizmů, tzv. SNP

77
00:03:09,215 --> 00:03:12,020
ve spojení s moderními velkoformátovými

78
00:03:12,020 --> 00:03:13,984
metodami testování zvířat.

79
00:03:14,746 --> 00:03:16,870
Základními požadavky pro moderní metody

80
00:03:16,870 --> 00:03:19,035
je vysoká spolehlivost zamítnutí, a nebo

81
00:03:19,035 --> 00:03:21,409
potvrzení rodičovství, rychlost a

82
00:03:21,409 --> 00:03:23,213
jednoduchost testování, vysoká

83
00:03:23,213 --> 00:03:25,818
reprodukovatelnost a v neposlední řadě co

84
00:03:25,818 --> 00:03:26,620
nejnižší cena.

85
00:03:28,955 --> 00:03:31,600
Už jsou to mikrosatelity? Jsou to krátké

86
00:03:31,600 --> 00:03:34,085
repetitivní sekvence, tzv. tandemové

87
00:03:34,085 --> 00:03:36,009
repetice, které se skládají z

88
00:03:36,009 --> 00:03:38,975
mono, di, tri nebo tetra nukleotidových motivů.

89
00:03:39,416 --> 00:03:41,941
Jsou vysoce polymorfní, to znamená počet

90
00:03:41,941 --> 00:03:43,384
jejich alelických forem je velmi

91
00:03:43,384 --> 00:03:45,669
vysoký. Řadíme je mezi délkové

92
00:03:45,669 --> 00:03:48,394
polymorfismy. Sekvenci s mikrosatelity

93
00:03:48,394 --> 00:03:51,040
můžeme amplifikovat pomocí PCR

94
00:03:51,040 --> 00:03:52,843
a elektrofrézou poté detekovat jejich

95
00:03:52,843 --> 00:03:55,168
délku, která je dána rozdílným počtem

96
00:03:55,168 --> 00:03:57,683
repetic. Označení ale jednotlivých

97
00:03:57,683 --> 00:04:00,128
mikrosatelitů je dáno velikostí této

98
00:04:00,128 --> 00:04:01,170
sekvence v počtech bází.

99
00:04:03,665 --> 00:04:05,790
Na schématu vidíte ukázku pouze 3

100
00:04:05,790 --> 00:04:08,635
alel jednoho mikrosatelitu, které se liší počtem

101
00:04:08,635 --> 00:04:11,321
opakování repetice GC

102
00:04:11,321 --> 00:04:13,084
a velikost jejich PCR produktu se tak

103
00:04:13,084 --> 00:04:15,610
liší, přičemž jejich kombinace mohou dát

104
00:04:15,610 --> 00:04:18,375
celkem 6 různých genotipů. Velikost

105
00:04:18,375 --> 00:04:20,740
alely zjistíme elektroforézou, zde je pro

106
00:04:20,740 --> 00:04:22,824
názornost schéma gelové elektroforézy.

107
00:04:25,450 --> 00:04:27,734
U různých druhů zvířat se používají různé

108
00:04:27,734 --> 00:04:29,618
sady mikrosatelitů neboli panely

109
00:04:30,059 --> 00:04:32,744
v minimálním počtu 10, což je dostatečné

110
00:04:32,744 --> 00:04:34,909
pro vysoce spolehlivé ověření parentity.

111
00:04:35,390 --> 00:04:38,035
U člověka se používá pro paternitu 15 až

112
00:04:38,035 --> 00:04:38,957
22 těchto markerů.

113
00:04:41,362 --> 00:04:43,005
Jsou vyvíjeny i další panely

114
00:04:43,005 --> 00:04:45,570
mikrosatelitů pro jiné druhy zvířat a

115
00:04:45,570 --> 00:04:47,855
umožňují kromě testu parentity i studovat

116
00:04:47,855 --> 00:04:49,619
genetickou diverzitu populace.

117
00:04:52,525 --> 00:04:54,729
Na tomto obrázku vidíte jednotlivé kroky

118
00:04:54,729 --> 00:04:57,014
ověření rodičovství u zvířat pomocí

119
00:04:57,014 --> 00:04:59,779
mikrosatelitů. Izolace DNA je možná z

120
00:04:59,779 --> 00:05:01,904
jakéhokoliv biologického materiálu, který

121
00:05:01,904 --> 00:05:03,948
obsahuje byť minimální množství DNA.

122
00:05:04,669 --> 00:05:07,515
Následuje multiplexní PCR reakce, která

123
00:05:07,515 --> 00:05:08,998
specificky namnoží jednotlivé

124
00:05:08,998 --> 00:05:11,203
mikrosatelity dohromady v 1 zkumavce.

125
00:05:11,884 --> 00:05:13,688
Jejich velikost je pak určena pomocí

126
00:05:13,688 --> 00:05:16,533
přesné kapilární elektroforézy. Následuje

127
00:05:16,533 --> 00:05:19,249
určení alel pro jednotlivé mikrosatelity.

128
00:05:19,890 --> 00:05:22,295
Srovnáním genetického typu rodičů a

129
00:05:22,295 --> 00:05:24,339
potomka je možné ověřit rodičovství.

130
00:05:27,907 --> 00:05:30,592
Podstatou multiplexní PCR je to, 

131
00:05:30,953 --> 00:05:33,237
že během 1 reakce dochází k namnožení

132
00:05:33,237 --> 00:05:36,203
více fragmentů DNA a to v závislosti na

133
00:05:36,203 --> 00:05:39,089
počtu primerů přidaných do reakce. Jeden z

134
00:05:39,089 --> 00:05:41,254
primerů daného páru musí být vždy označen

135
00:05:41,254 --> 00:05:44,140
specifickou fluorescenční barvou. Při

136
00:05:44,140 --> 00:05:46,825
designu primerů je třeba dbát na to, že

137
00:05:46,825 --> 00:05:48,428
rozsahy velikostí alel různých

138
00:05:48,428 --> 00:05:50,392
mikrosatelitů v jedné barvě se nesmí

139
00:05:50,392 --> 00:05:52,436
překrývat, jinak by nebylo možné je

140
00:05:52,436 --> 00:05:54,761
navzájem rozlišit. Reakce probíhá v

141
00:05:54,761 --> 00:05:56,926
termálním cykleru. Výsledkem je

142
00:05:56,926 --> 00:05:59,130
mikrozkumavka obsahující amplikony

143
00:05:59,130 --> 00:06:01,695
různých délek a lze tak celou analýzu

144
00:06:01,695 --> 00:06:03,018
provést v 1 zkumavce.

145
00:06:05,884 --> 00:06:07,928
Směs PCR fragmentů mnoha různých

146
00:06:07,928 --> 00:06:09,932
mikrosatelitů je třeba rozlišit podle

147
00:06:09,932 --> 00:06:12,377
velikosti a barvy. K tomu slouží

148
00:06:12,377 --> 00:06:15,183
fluorescenční kapilární elektroforéza. Ta

149
00:06:15,183 --> 00:06:17,427
umožňuje velmi přesné určení velikosti

150
00:06:17,427 --> 00:06:20,313
jednotlivých fragmentů, tzn. alel

151
00:06:20,313 --> 00:06:22,958
a provádí se pomocí genetického analyzátoru.

152
00:06:24,852 --> 00:06:26,856
Konkrétní velikost jednotlivých alel je

153
00:06:26,856 --> 00:06:28,901
určena pomocí srovnání s kalibrační

154
00:06:28,941 --> 00:06:31,426
křivkou velikostního standardu. To je

155
00:06:31,426 --> 00:06:33,309
směs DNA fragmentů známé délky.

156
00:06:34,271 --> 00:06:36,195
Velikostní standard se separuje vždy s

157
00:06:36,195 --> 00:06:38,560
každým vzorkem dohromady a rozliší se

158
00:06:38,560 --> 00:06:39,923
pomocí oranžové barvy.

159
00:06:43,049 --> 00:06:45,174
Výsledek elektroforézie můžeme sledovat

160
00:06:45,174 --> 00:06:47,138
pomocí surových dat. Na

161
00:06:47,138 --> 00:06:49,302
elektroforetogramu vidíme píky, které

162
00:06:49,302 --> 00:06:51,025
odpovídají jednotlivým mikrosatelitům

163
00:06:51,627 --> 00:06:54,072
(červené, modré, zelené a černé)

164
00:06:54,593 --> 00:06:56,877
a velikostnímu standardu, který je oranžový.

165
00:06:59,573 --> 00:07:02,138
Software genetickýho analyzátoru umožňuje

166
00:07:02,138 --> 00:07:05,024
automatické vyhodnocení - určení velikosti

167
00:07:05,024 --> 00:07:07,870
jednotlivých píků, které odpovídají alelám.

168
00:07:07,870 --> 00:07:10,675
Získáme tak genotyp jednotlivých

169
00:07:10,675 --> 00:07:13,080
mikrosatelitů jedince, tzv.

170
00:07:13,080 --> 00:07:15,926
genetický typ. Srovnáním s rodiči

171
00:07:15,926 --> 00:07:18,812
můžeme ověřit rodičovství nebo srovnáním s

172
00:07:18,812 --> 00:07:20,896
jiným vzorkem provést identifikaci

173
00:07:20,896 --> 00:07:21,457
jedince.

174
00:07:25,756 --> 00:07:27,961
A to je vše k této krátké prezentaci

175
00:07:27,961 --> 00:07:30,045
vysvětlující genetické testování

176
00:07:30,045 --> 00:07:32,570
rodičovství u zvířat. Pro ukázku

177
00:07:32,570 --> 00:07:35,215
praktického provedení analýzy sledujte

178
00:07:35,215 --> 00:07:38,021
prezentaci Laboratorní příklady. Děkuji

179
00:07:38,021 --> 00:07:38,742
za pozornost.