Dobrý den, v této přednášce se budeme
zabývat genetickým testováním rodičovství
u zvířat, konkrétně laboratorními postupy
této analýzy. Přednáška je
součástí modulu 4 Precizní
chov hospodářských zvířat.
Vytvoření této prezentace bylo podpořeno
grantem Erasmus+ KA2 v
rámci projektu ISAGREED,
Inovace obsahu a struktury studijních
programů v oblasti managementu
živočišných genetických a potravinových
zdrojů s využitím digitalizace.
A jaké jsou jednotlivé kroky samotné
analýzy? Nejprve je potřeba
izolovat DNA z biologického
materiálu a ověřit její kvalitu.
Dále pomocí multiplexní PCR
amplifikovat fragmenty a
fragmentační analýzou získané amplikony
separovat. Speciální počítačový
program poté výsledky fragmentační
analýzy automaticky porovná s kalibrační
křivkou standardu a určí alely
jednotlivých mikrosatelitů. Po
získání genetického profilu jedince poté
následuje ověření rodičovství.
A teď si popíšeme jednotlivé kroky
konkrétněji.
Prvním a nezbytným krokem většiny
molekulárně genetických metod je izolace
DNA. DNA lze
izolovat téměř z každého biologického
materiálu, například z krve,
svaloviny, stěrů bukální
sliznice, mléka, peří
vlasových nebo chlupových cibulek,
spermatu a tak dále. Kvalita
a množství izolované DNA velmi
ovlivňuje průběh následných reakcí.
Existuje několik izolačních metod.
Metoda je zvolena podle materiálu, ze
kterého se DNA izoluje a dále
podle množství a kvality biologického
materiálu. V současné době patří
mezi nejpoužívanější metody izolace DNA
takzvaná kolonková metoda, která se
řadí do skupiny metod využívajících pro
izolaci DNA pevné částice.
Výhodou kolonkové metody je především
rychlost, jednoduchost,
vysoká spolehlivost a dobrá kvalita a
čistota získané DNA.
Podstatou této metody je absorpce DNA
na silikátovou membránu, její
promytí a následné uvolnění do zkumavky.
Prvním krokem je příprava biologického
materiálu, ze kterého bude DNA
izolována, a jeho případná homogenizace.
Na obrázcích jsou nejčastější materiály
používané pro izolaci DNA u zvířat,
tj. krev, tkáň, například
svalovina, a chlupové cibulky,
jejichž výhodou je snadný neinvazivní
odběr a snadné uložení a odeslání
materiálu chovateli na analýzu.
K biologickému materiálu se přidává
lyzační pufr a
proteináza K. Po
inkubaci při zvýšené teplotě dojde k
vytvoření lyzátu, ve kterém je DNA
uvolněna z buněčného jádra a
proteiny jsou degradovány.
Vzniklý lyzát je přepipetován na kolonu
se silikátovou matricí.
V dalším kroku je pomocí centrifugace
DNA navázána na silikátovou
matrici uvnitř kolony. V dalších
dvou krocích je navázaná DNA
promývána pomocí promývacích pufrů
a tím jsou odstraněny všechny nečistoty.
Přečištěná DNA je v posledním kroku
uvolněna do roztoku elučního pufru.
Takto izolovanou DNA použijeme pro další
analýzy.
Po izolaci DNA je vždy potřebné ověřit
její množství, to znamená, jestli se
izolace zdařila. Nejběžnějším
způsobem ověření množství izolované DNA
je agarózová gelová elektroforéza.
V tomto případě použijeme 2%
agarózový gel. Nejprve si
navážíme 2 g agarózy, což je
přečištěný polysacharid z mořských řas.
Tento bílý prášek rozvaříme ve 100
ml elektroforetického pufru.
V našem případě se jedná o TBE
pufr (tris-borat+EDTA).
Tím dostaneme 2% koncentraci
gelu. Rozvaření probíhá v
mikrovlnné troubě do té doby, než je
roztok zcela homogenní a čirý.
Po důkladném rozvaření přidáváme
vizualizační barvu, v našem případě
GoodView, vše nalijeme do připravené
vaničky a vložíme hřebínky.
Gel necháme ztuhnout.
Po ztuhnutí gel vložíme do
elektroforotické vany naplněné
elektroforetickým TBE pufrem,
vyjmeme hřebínky a do vzniklých
jamek nanášíme vzorky DNA.
DNA musí být smíchána s nanášecím pufrem,
který obsahuje indikátorovou barvu,
obvykle bromfenolovou modř, a hustou
látku, například sacharózu nebo glycerol.
To umožní správné nanesení DNA na
dno jamky.
Součástí každého gelu musí být i
minimálně 1 sloupeček s tzv.
velikostním standardem. Jedná se o
směs DNA různých a přesně
definovaných velikostí,
které slouží k tomu, abychom dokázali
odvodit či ověřit velikost vzorků.
Po nanesení všech vzorků DNA elektroforetickou
vanu připojíme pomocí elektrod
ke zdroji elektrického napětí,
nastavíme potřebné parametry - v našem
případě 130 V a 30 minut,
a elektroforézu spustíme.
Po skončení separace vizualizujeme
výsledek pomocí UV světla. Na
výsledném elektroforetogramu vidíme
v první jamce napipetovaný velikostní
standard pro hrubou kvantifikaci
výsledků, v dalších jamkách poté
izolovanou DNA různé intenzity,
tedy různé kvality. Po tomto
elektroforatickém ověření izolace je DNA
použita pro další kroky molekulárně
genetické analýzy.
Poslední obrázek týkající se
elektroforézy nám ilustruje
souhrnně základní kroky
agarózové gelové elektroforézy.
Dalším krokem je multiplexní PCR.
Multiplexní PCR je jednou z mnoha
modifikací PCR reakce. Její
podstata spočívá v tom, že během jedné
reakce dochází k namnožení více
fragmentů DNA a to v závislosti na
počtu primerů přidaných do reakce.
Vše probíhá v termálním cykleru.
Zde je nastaven teplotní profil
jednotlivých kroků reakce a počet
opakování.
Výsledkem je mikrozkumavka obsahující
amplikony různých délek.
Počet amplikonů odpovídá počtu
mikrosatelitů, které jsou u daného
jedince stanovovány. Jak ale tuto
reakci vyhodnotit, jak odečíst velikosti
jednotlivých PCR produktů?
Při použití klasické agarozové
elektroforézy nelze všechny
lokusy, respektive alely rozlišit.
Díky tomu, že byly do reakce přidány
fluorescenčně značené primery,
lze k odečtu výsledků použít
kapilárovou elektroforézu
probíhající v genetickém analyzátoru.
Na multiplexní PCR tedy
navazuje fragmentační analýza.
Samotná fragmentační analýza probíhá ve
speciálním genetickém analyzátoru.
Analýza je založena na kapilární
elektroforéze a následné
fluorescenční detekci jednotlivých
amplifikovaných fragmentů.
Jejím cílem je zjistit délku fragmentu
DNA, která je vymezená dvěma primery.
První primer je fluorecenčně značený,
druhý značený není.
Výhoda použití této metody spočívá v tom,
že lze analyzovat více fragmentů
současně. Fragmenty se musí
lišit délkou nebo být označeny
fluorescenční barvou. Ke
každému vzorku je nutné přidat takzvaný
velikostní standard.
Ovládání genetického analyzátoru probíhá
podobně jako v případě sekvenování.
Demonstraci činnosti tohoto přístroje
můžete vidět v kapitole modulu 1: Ukázka
sekvenování.
Po dokončení fragmentační analýzy dojde k
vyhodnocení výsledků ve speciálním
programu, například GeneMapperu.
Nejprve je potřeba zkontrolovat kvalitu
surových dat. Ta vypadají takto.
Na obrázku můžete vidět výsledný
elektroforetogram setu 17
mikrosatelitů u koní.
Jednotlivé mikrosatelity jsou rozděleny do
4 barev a to z toho důvodu, aby
se jejich alely velikostně nepřekrývaly
a výsledné genotypy byly správně odečteny
a určeny. Každý
mikrosatelit se skládá z 1 nebo 2
píků, které označují alely
daného mikrosatelitu. Pokud se
v genotypu vybraného mikrosatelitu
vyskytne jedna alela, zkoumaný
jedinec je v něm homozygotní.
Pokud má mikrosatelit detekovány dvě
alely, jedná se o heterozygota.
Výsledkem fragmentační analýzy je tedy
stanovený set mikrosatelitů
daného jedince. Při
ověřování rodičovství u zvířat se
porovnávají vybrané sety mikrosatelitů
rodičů a potomka.
Obecně platí, že příslušný lokus,
respektive gen, se vždy u jedince
vyskytuje na dvou homologických
chromozomech, přičemž každý z
nich je zděděn od konkrétního rodiče.
Na základě toho lze poté určit,
zda je daný jedinec potomek uvedených
rodičů. Vše si ukážeme na
konkrétním příkladu. Na tomto
obrázku vidíte výsledné genotypy setu
17 mikrosatelitů koní u potomka a
jeho případných rodičů.
Úkolem je zjistit, zda jsou uvedení
rodiče opravdu rodiči daného potomka.
Pokud jsou, bude mít potomek v genotypech
svých mikrosatelitů jednu alelu
od otce a druhou od matky.
Jak můžeme u potomka vidět,
genotypy jednotlivých lokusů se opravdu
skládají z jedné alely zděděné od
otce, vyznačené modrou barvou, a z jedné
alely zděděné od matky,
vyznačeno červenou barvou. V tomto
případě genetické testování rodičovství
potvrdilo. Mohou nastat další
případy, kdy genetická analýza
vyloučí jednoho z rodičů, případně vyloučí
oba rodiče.
A to je vše k této krátké prezentaci
vysvětlující genetické testování
rodičovství u zvířat.
Děkuji Vám za pozornost.