1
00:00:01,052 --> 00:00:03,978
Dobrý den, v této přednášce se budeme

2
00:00:03,978 --> 00:00:06,423
zabývat genetickým testováním rodičovství

3
00:00:06,423 --> 00:00:09,308
u zvířat, konkrétně laboratorními postupy

4
00:00:09,308 --> 00:00:11,713
této analýzy. Přednáška je

5
00:00:11,713 --> 00:00:14,439
součástí modulu 4 Precizní

6
00:00:14,439 --> 00:00:16,082
chov hospodářských zvířat.

7
00:00:16,924 --> 00:00:19,809
Vytvoření této prezentace bylo podpořeno

8
00:00:19,809 --> 00:00:22,735
grantem Erasmus+ KA2 v

9
00:00:22,735 --> 00:00:24,258
rámci projektu ISAGREED,

10
00:00:25,491 --> 00:00:27,214
Inovace obsahu a struktury studijních

11
00:00:27,214 --> 00:00:29,178
programů v oblasti managementu

12
00:00:29,178 --> 00:00:31,823
živočišných genetických a potravinových

13
00:00:31,823 --> 00:00:34,238
zdrojů s využitím digitalizace.

14
00:00:36,072 --> 00:00:38,436
A jaké jsou jednotlivé kroky samotné

15
00:00:38,436 --> 00:00:40,801
analýzy? Nejprve je potřeba

16
00:00:40,801 --> 00:00:43,085
izolovat DNA z biologického

17
00:00:43,085 --> 00:00:45,891
materiálu a ověřit její kvalitu.

18
00:00:46,963 --> 00:00:49,488
Dále pomocí multiplexní PCR

19
00:00:49,689 --> 00:00:51,933
amplifikovat fragmenty a

20
00:00:51,933 --> 00:00:54,739
fragmentační analýzou získané amplikony

21
00:00:54,739 --> 00:00:57,704
separovat. Speciální počítačový

22
00:00:57,704 --> 00:00:59,949
program poté výsledky fragmentační

23
00:00:59,949 --> 00:01:02,875
analýzy automaticky porovná s kalibrační

24
00:01:02,875 --> 00:01:05,760
křivkou standardu a určí alely

25
00:01:05,760 --> 00:01:08,486
jednotlivých mikrosatelitů. Po

26
00:01:08,486 --> 00:01:11,372
získání genetického profilu jedince poté

27
00:01:11,372 --> 00:01:13,536
následuje ověření rodičovství.

28
00:01:14,538 --> 00:01:16,582
A teď si popíšeme jednotlivé kroky

29
00:01:16,582 --> 00:01:17,504
konkrétněji.

30
00:01:19,608 --> 00:01:21,932
Prvním a nezbytným krokem většiny

31
00:01:21,932 --> 00:01:24,457
molekulárně genetických metod je izolace

32
00:01:24,457 --> 00:01:27,383
DNA. DNA lze

33
00:01:27,383 --> 00:01:29,788
izolovat téměř z každého biologického

34
00:01:29,788 --> 00:01:31,832
materiálu, například z krve,

35
00:01:31,992 --> 00:01:34,357
svaloviny, stěrů bukální

36
00:01:34,357 --> 00:01:37,123
sliznice, mléka, peří

37
00:01:37,523 --> 00:01:39,648
vlasových nebo chlupových cibulek,

38
00:01:39,648 --> 00:01:42,613
spermatu a tak dále. Kvalita

39
00:01:42,613 --> 00:01:45,058
a množství izolované DNA velmi

40
00:01:45,058 --> 00:01:47,623
ovlivňuje průběh následných reakcí.

41
00:01:48,766 --> 00:01:50,970
Existuje několik izolačních metod.

42
00:01:51,491 --> 00:01:53,816
Metoda je zvolena podle materiálu, ze

43
00:01:53,816 --> 00:01:56,581
kterého se DNA izoluje a dále

44
00:01:56,581 --> 00:01:58,745
podle množství a kvality biologického

45
00:01:58,745 --> 00:02:01,711
materiálu. V současné době patří

46
00:02:01,711 --> 00:02:04,276
mezi nejpoužívanější metody izolace DNA

47
00:02:04,357 --> 00:02:07,242
takzvaná kolonková metoda, která se

48
00:02:07,242 --> 00:02:09,807
řadí do skupiny metod využívajících pro

49
00:02:09,807 --> 00:02:12,172
izolaci DNA pevné částice.

50
00:02:14,948 --> 00:02:17,352
Výhodou kolonkové metody je především

51
00:02:17,392 --> 00:02:19,597
rychlost, jednoduchost,

52
00:02:20,078 --> 00:02:23,004
vysoká spolehlivost a dobrá kvalita a

53
00:02:23,004 --> 00:02:24,527
čistota získané DNA.

54
00:02:25,719 --> 00:02:28,244
Podstatou této metody je absorpce DNA

55
00:02:28,244 --> 00:02:31,009
na silikátovou membránu, její

56
00:02:31,009 --> 00:02:33,895
promytí a následné uvolnění do zkumavky.

57
00:02:35,098 --> 00:02:37,502
Prvním krokem je příprava biologického

58
00:02:37,502 --> 00:02:39,747
materiálu, ze kterého bude DNA

59
00:02:39,747 --> 00:02:42,432
izolována, a jeho případná homogenizace.

60
00:02:43,554 --> 00:02:46,400
Na obrázcích jsou nejčastější materiály

61
00:02:46,400 --> 00:02:48,885
používané pro izolaci DNA u zvířat,

62
00:02:49,887 --> 00:02:52,412
tj. krev, tkáň, například

63
00:02:52,412 --> 00:02:54,656
svalovina, a chlupové cibulky,

64
00:02:55,298 --> 00:02:58,183
jejichž výhodou je snadný neinvazivní

65
00:02:58,183 --> 00:03:00,869
odběr a snadné uložení a odeslání

66
00:03:00,869 --> 00:03:03,153
materiálu chovateli na analýzu.

67
00:03:07,051 --> 00:03:09,897
K biologickému materiálu se přidává

68
00:03:09,897 --> 00:03:11,740
lyzační pufr a

69
00:03:11,740 --> 00:03:14,295
proteináza K. Po

70
00:03:14,295 --> 00:03:16,860
inkubaci při zvýšené teplotě dojde k

71
00:03:16,860 --> 00:03:19,506
vytvoření lyzátu, ve kterém je DNA

72
00:03:19,506 --> 00:03:22,071
uvolněna z buněčného jádra a

73
00:03:22,071 --> 00:03:23,714
proteiny jsou degradovány.

74
00:03:24,636 --> 00:03:27,361
Vzniklý lyzát je přepipetován na kolonu

75
00:03:27,361 --> 00:03:29,125
se silikátovou matricí.

76
00:03:38,553 --> 00:03:41,319
V dalším kroku je pomocí centrifugace

77
00:03:41,319 --> 00:03:43,764
DNA  navázána na silikátovou

78
00:03:43,764 --> 00:03:46,730
matrici uvnitř kolony. V dalších

79
00:03:46,730 --> 00:03:49,014
 dvou krocích je navázaná DNA

80
00:03:49,014 --> 00:03:51,780
promývána pomocí promývacích pufrů

81
00:03:52,180 --> 00:03:54,826
a tím jsou odstraněny všechny nečistoty.

82
00:03:55,507 --> 00:03:57,832
Přečištěná DNA je v posledním kroku

83
00:03:57,832 --> 00:04:00,156
uvolněna do roztoku elučního pufru.

84
00:04:00,918 --> 00:04:03,803
Takto izolovanou DNA použijeme pro další

85
00:04:03,803 --> 00:04:04,325
analýzy.

86
00:04:07,130 --> 00:04:10,096
Po izolaci DNA je vždy potřebné ověřit

87
00:04:10,096 --> 00:04:12,581
její množství, to znamená, jestli se

88
00:04:12,581 --> 00:04:15,106
izolace zdařila. Nejběžnějším

89
00:04:15,106 --> 00:04:17,791
způsobem ověření množství izolované DNA

90
00:04:17,791 --> 00:04:20,757
je agarózová gelová elektroforéza.

91
00:04:21,639 --> 00:04:24,004
V tomto případě použijeme 2%

92
00:04:24,004 --> 00:04:26,488
agarózový gel. Nejprve si

93
00:04:26,488 --> 00:04:29,174
navážíme 2 g agarózy, což je

94
00:04:29,174 --> 00:04:31,699
přečištěný polysacharid z mořských řas.

95
00:04:32,771 --> 00:04:35,697
Tento bílý prášek rozvaříme ve 100

96
00:04:35,697 --> 00:04:38,262
ml elektroforetického pufru.

97
00:04:38,743 --> 00:04:41,308
V našem případě se jedná o TBE

98
00:04:41,308 --> 00:04:43,833
pufr (tris-borat+EDTA).

99
00:04:44,875 --> 00:04:47,480
Tím dostaneme 2% koncentraci

100
00:04:47,480 --> 00:04:49,965
gelu. Rozvaření probíhá v

101
00:04:49,965 --> 00:04:52,490
mikrovlnné troubě do té doby, než je

102
00:04:52,490 --> 00:04:54,654
roztok zcela homogenní a čirý.

103
00:04:58,041 --> 00:05:00,406
Po důkladném rozvaření přidáváme

104
00:05:00,406 --> 00:05:02,730
vizualizační barvu, v našem případě

105
00:05:02,730 --> 00:05:05,696
GoodView, vše nalijeme do připravené

106
00:05:05,696 --> 00:05:08,502
vaničky a vložíme hřebínky.

107
00:05:09,524 --> 00:05:11,167
Gel necháme ztuhnout.

108
00:05:18,963 --> 00:05:21,127
Po ztuhnutí gel vložíme do

109
00:05:21,127 --> 00:05:23,291
elektroforotické vany naplněné

110
00:05:23,291 --> 00:05:25,536
elektroforetickým TBE pufrem,

111
00:05:26,097 --> 00:05:28,622
vyjmeme hřebínky a do vzniklých

112
00:05:28,622 --> 00:05:31,507
jamek nanášíme vzorky DNA.

113
00:05:32,570 --> 00:05:35,375
DNA musí být smíchána s nanášecím pufrem,

114
00:05:35,455 --> 00:05:37,780
který obsahuje indikátorovou barvu,

115
00:05:37,980 --> 00:05:40,826
obvykle bromfenolovou modř, a hustou

116
00:05:40,826 --> 00:05:43,712
látku, například sacharózu nebo glycerol.

117
00:05:44,233 --> 00:05:46,838
To umožní správné nanesení DNA na

118
00:05:47,118 --> 00:05:47,880
dno jamky.

119
00:06:00,465 --> 00:06:03,110
Součástí každého gelu musí být i

120
00:06:03,110 --> 00:06:05,755
minimálně 1 sloupeček s tzv.

121
00:06:05,755 --> 00:06:08,681
velikostním standardem. Jedná se o

122
00:06:08,681 --> 00:06:11,607
směs DNA různých a přesně

123
00:06:11,607 --> 00:06:13,010
definovaných velikostí,

124
00:06:14,583 --> 00:06:16,306
které slouží k tomu, abychom dokázali

125
00:06:16,306 --> 00:06:18,631
odvodit či ověřit velikost vzorků.

126
00:06:21,787 --> 00:06:24,232
Po nanesení všech vzorků DNA elektroforetickou

127
00:06:24,553 --> 00:06:27,478
vanu připojíme pomocí elektrod

128
00:06:27,478 --> 00:06:29,683
ke zdroji elektrického napětí,

129
00:06:30,404 --> 00:06:32,849
nastavíme potřebné parametry - v našem

130
00:06:32,849 --> 00:06:35,534
případě 130 V a 30 minut,

131
00:06:35,534 --> 00:06:38,300
a elektroforézu spustíme.

132
00:06:39,342 --> 00:06:41,626
Po skončení separace vizualizujeme

133
00:06:41,626 --> 00:06:44,552
výsledek pomocí UV světla. Na

134
00:06:44,552 --> 00:06:46,917
výsledném elektroforetogramu vidíme

135
00:06:46,917 --> 00:06:49,402
v první jamce napipetovaný velikostní

136
00:06:49,402 --> 00:06:51,446
standard pro hrubou kvantifikaci

137
00:06:51,446 --> 00:06:54,372
výsledků, v dalších jamkách poté

138
00:06:54,372 --> 00:06:57,057
izolovanou DNA různé intenzity,

139
00:06:57,257 --> 00:06:59,983
tedy různé kvality. Po tomto

140
00:06:59,983 --> 00:07:02,788
elektroforatickém ověření izolace je DNA

141
00:07:02,788 --> 00:07:05,754
použita pro další kroky molekulárně

142
00:07:05,754 --> 00:07:06,957
genetické analýzy.

143
00:07:09,281 --> 00:07:11,486
Poslední obrázek týkající se

144
00:07:11,486 --> 00:07:14,011
elektroforézy nám ilustruje

145
00:07:14,011 --> 00:07:16,656
souhrnně základní kroky

146
00:07:16,656 --> 00:07:18,780
agarózové gelové elektroforézy.

147
00:07:24,381 --> 00:07:27,187
Dalším krokem je multiplexní PCR.

148
00:07:27,988 --> 00:07:30,313
Multiplexní PCR je jednou z mnoha

149
00:07:30,313 --> 00:07:33,239
modifikací PCR reakce. Její

150
00:07:33,239 --> 00:07:36,044
podstata spočívá v tom, že během jedné

151
00:07:36,044 --> 00:07:38,970
reakce dochází k namnožení více

152
00:07:38,970 --> 00:07:41,816
fragmentů DNA a to v závislosti na

153
00:07:41,816 --> 00:07:44,341
počtu primerů přidaných do reakce.

154
00:07:45,874 --> 00:07:47,798
Vše probíhá v termálním cykleru.

155
00:07:48,880 --> 00:07:51,124
Zde je nastaven teplotní profil

156
00:07:51,124 --> 00:07:53,930
jednotlivých kroků reakce a počet

157
00:07:53,930 --> 00:07:54,731
opakování.

158
00:08:03,098 --> 00:08:05,703
Výsledkem je mikrozkumavka obsahující

159
00:08:05,703 --> 00:08:07,667
amplikony různých délek.

160
00:08:08,389 --> 00:08:10,433
Počet amplikonů odpovídá počtu

161
00:08:10,433 --> 00:08:12,877
mikrosatelitů, které jsou u daného

162
00:08:12,877 --> 00:08:15,843
jedince stanovovány. Jak ale tuto

163
00:08:15,843 --> 00:08:18,729
reakci vyhodnotit, jak odečíst velikosti

164
00:08:18,729 --> 00:08:20,693
jednotlivých PCR produktů?

165
00:08:21,575 --> 00:08:23,539
Při použití klasické agarozové

166
00:08:23,539 --> 00:08:25,903
elektroforézy nelze všechny

167
00:08:25,903 --> 00:08:28,549
lokusy, respektive alely rozlišit.

168
00:08:29,681 --> 00:08:32,526
Díky tomu, že byly do reakce přidány

169
00:08:32,526 --> 00:08:34,691
fluorescenčně značené primery,

170
00:08:35,252 --> 00:08:37,416
lze k odečtu výsledků použít

171
00:08:37,416 --> 00:08:39,420
kapilárovou elektroforézu

172
00:08:39,620 --> 00:08:42,025
probíhající v genetickém analyzátoru.

173
00:08:43,027 --> 00:08:45,352
Na multiplexní PCR tedy

174
00:08:45,352 --> 00:08:47,676
navazuje fragmentační analýza.

175
00:08:49,640 --> 00:08:52,366
Samotná fragmentační analýza probíhá ve

176
00:08:52,366 --> 00:08:54,690
speciálním genetickém analyzátoru.

177
00:08:55,813 --> 00:08:58,097
Analýza je založena na kapilární

178
00:08:58,097 --> 00:09:00,301
elektroforéze a následné

179
00:09:00,301 --> 00:09:02,626
fluorescenční detekci jednotlivých

180
00:09:02,626 --> 00:09:04,269
amplifikovaných fragmentů.

181
00:09:05,311 --> 00:09:08,077
Jejím cílem je zjistit délku fragmentu

182
00:09:08,077 --> 00:09:10,963
DNA, která je vymezená dvěma primery.

183
00:09:11,764 --> 00:09:14,209
První primer je fluorecenčně značený,

184
00:09:14,209 --> 00:09:15,411
druhý značený není.

185
00:09:16,774 --> 00:09:19,500
Výhoda použití této metody spočívá v tom,

186
00:09:20,021 --> 00:09:22,345
že lze analyzovat více fragmentů

187
00:09:22,345 --> 00:09:25,151
současně. Fragmenty se musí

188
00:09:25,151 --> 00:09:27,596
lišit délkou nebo být označeny

189
00:09:27,596 --> 00:09:30,241
fluorescenční barvou. Ke

190
00:09:30,241 --> 00:09:33,167
každému vzorku je nutné přidat takzvaný

191
00:09:33,167 --> 00:09:34,690
velikostní standard.

192
00:09:36,052 --> 00:09:38,898
Ovládání genetického analyzátoru probíhá

193
00:09:38,898 --> 00:09:41,423
podobně jako v případě sekvenování.

194
00:09:42,265 --> 00:09:44,629
Demonstraci činnosti tohoto přístroje

195
00:09:44,629 --> 00:09:47,595
můžete vidět v kapitole modulu 1: Ukázka

196
00:09:47,595 --> 00:09:48,437
sekvenování.

197
00:09:51,263 --> 00:09:53,988
Po dokončení fragmentační analýzy dojde k

198
00:09:53,988 --> 00:09:56,272
vyhodnocení výsledků ve speciálním

199
00:09:56,272 --> 00:09:58,276
programu, například GeneMapperu.

200
00:09:59,379 --> 00:10:01,543
Nejprve je potřeba zkontrolovat kvalitu

201
00:10:01,543 --> 00:10:04,268
surových dat. Ta vypadají takto.

202
00:10:08,998 --> 00:10:11,322
Na obrázku můžete vidět výsledný

203
00:10:11,322 --> 00:10:13,927
elektroforetogram setu 17

204
00:10:13,927 --> 00:10:15,611
mikrosatelitů u koní.

205
00:10:16,533 --> 00:10:19,058
Jednotlivé mikrosatelity jsou rozděleny do

206
00:10:19,058 --> 00:10:22,024
4 barev a to z toho důvodu, aby

207
00:10:22,024 --> 00:10:24,589
se jejich alely velikostně nepřekrývaly

208
00:10:25,029 --> 00:10:27,995
a výsledné genotypy byly správně odečteny

209
00:10:27,995 --> 00:10:30,160
a určeny. Každý

210
00:10:30,160 --> 00:10:33,126
mikrosatelit se skládá z 1 nebo 2

211
00:10:33,126 --> 00:10:35,731
píků, které označují alely

212
00:10:35,731 --> 00:10:38,697
daného mikrosatelitu. Pokud se

213
00:10:38,697 --> 00:10:40,781
v genotypu vybraného mikrosatelitu

214
00:10:40,781 --> 00:10:43,266
vyskytne jedna alela, zkoumaný

215
00:10:43,266 --> 00:10:45,230
jedinec je v něm homozygotní.

216
00:10:46,232 --> 00:10:48,997
Pokud má mikrosatelit detekovány dvě

217
00:10:48,997 --> 00:10:51,722
alely, jedná se o heterozygota.

218
00:10:52,805 --> 00:10:55,650
Výsledkem fragmentační analýzy je tedy

219
00:10:55,650 --> 00:10:58,376
stanovený set mikrosatelitů

220
00:10:58,536 --> 00:11:01,462
daného jedince. Při

221
00:11:01,462 --> 00:11:03,907
ověřování rodičovství u zvířat se

222
00:11:03,907 --> 00:11:06,792
porovnávají vybrané sety mikrosatelitů

223
00:11:06,872 --> 00:11:08,275
rodičů a potomka.

224
00:11:10,610 --> 00:11:13,215
Obecně platí, že příslušný lokus,

225
00:11:13,335 --> 00:11:16,141
respektive gen, se vždy u jedince

226
00:11:16,141 --> 00:11:18,425
vyskytuje na dvou homologických

227
00:11:18,425 --> 00:11:21,071
chromozomech, přičemž každý z

228
00:11:21,111 --> 00:11:23,716
nich je zděděn od konkrétního rodiče.

229
00:11:24,868 --> 00:11:27,553
Na základě toho lze poté určit,

230
00:11:27,714 --> 00:11:30,159
zda je daný jedinec potomek uvedených

231
00:11:30,159 --> 00:11:32,724
rodičů. Vše si ukážeme na

232
00:11:32,724 --> 00:11:35,289
konkrétním příkladu. Na tomto

233
00:11:35,289 --> 00:11:38,175
obrázku vidíte výsledné genotypy setu

234
00:11:38,175 --> 00:11:41,020
 17 mikrosatelitů koní u potomka a

235
00:11:41,020 --> 00:11:42,383
jeho případných rodičů.

236
00:11:43,956 --> 00:11:45,840
Úkolem je zjistit, zda jsou uvedení

237
00:11:45,840 --> 00:11:48,645
rodiče opravdu rodiči daného potomka.

238
00:11:49,607 --> 00:11:51,972
Pokud jsou, bude mít potomek v genotypech 

239
00:11:51,972 --> 00:11:54,777
svých mikrosatelitů jednu alelu

240
00:11:54,777 --> 00:11:56,701
od otce a druhou od matky.

241
00:11:58,535 --> 00:12:00,379
Jak můžeme u potomka vidět, 

242
00:12:01,020 --> 00:12:03,505
genotypy jednotlivých lokusů se opravdu

243
00:12:03,505 --> 00:12:06,190
skládají z jedné alely zděděné od

244
00:12:06,190 --> 00:12:08,956
otce, vyznačené modrou barvou, a z jedné

245
00:12:09,797 --> 00:12:12,042
alely zděděné od matky,

246
00:12:12,362 --> 00:12:15,288
vyznačeno červenou barvou. V tomto

247
00:12:15,288 --> 00:12:18,254
případě genetické testování rodičovství

248
00:12:18,254 --> 00:12:21,220
potvrdilo. Mohou nastat další

249
00:12:21,220 --> 00:12:23,865
případy, kdy genetická analýza

250
00:12:23,865 --> 00:12:26,831
vyloučí jednoho z rodičů, případně vyloučí

251
00:12:26,831 --> 00:12:27,512
oba rodiče.

252
00:12:30,438 --> 00:12:33,003
A to je vše k této krátké prezentaci

253
00:12:33,204 --> 00:12:35,328
vysvětlující genetické testování

254
00:12:35,328 --> 00:12:37,000
rodičovství u zvířat. 

255
00:12:37,100 --> 00:12:38,334
Děkuji Vám za pozornost.